酶联免疫吸附资料.ppt

酶免疫技术 EIA;拟探讨的问题;概念 以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。;酶免疫技术类型（按抗原抗体系统的定位划分）;均相酶免疫测定 利用酶标记物结合抗原抗体复合物后，标记酶的活性就受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物，直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量。常用于半抗原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。;抗体;克隆酶供体免疫分析（CEDIA）;ED;异相酶免疫测定;酶联免疫吸附测定;ELISA的原理;ELISA过程;3、酶与该酶底物反应 抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体复合 物与该酶的底物反应生成有色产物。 4、检测 借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。 待测抗体(抗原)的定量与有色产物成正比。;ELISA的试剂;完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： ;1免疫吸附剂 　　 已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2-8℃） 干燥的条件下一般可保存6个月。;1.2 　包被的方式;DNA抗原的包被 ;脂类物质的包被 可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待 酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。 ;1.5 　包被的条件;2 结合物;2.1　酶; 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 制备结合物时所用抗体一般 均为纯度较高的 IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。 在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求 是抗原必须是高纯度的。 ;2.3 　结合物的制备 　　酶标记抗体的制备方法主要有两种 交联法：可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶和抗体（抗原）的方法，形成酶-交联剂-抗体（抗原）。 戊二醛交联法 碱性磷酸酶 ;直接法：用一活化剂首先将酶活化，被活化的 酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形 成标记物。形成的标记物为酶-抗体（抗原）。;2.4　结合物的保存 需加入蛋白保护剂（蛋白酶抑制剂） 再加入抗生素（庆大霉素）和防腐剂 HRP结合物加硫柳泵 AP结合物可加叠氮钠，以防止细菌生长。 冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右 加入等体积甘油可在低温冰箱或普通冰箱中保存较长时间 ;2.5 　结合物的稀释液 为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在 稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛 血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。 一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离 子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。;3 　酶的底物 ;四甲基联苯胺(3,3,5,5tetramethylbenzidine,TMB) 产物显蓝色，酶反应用HCL或H2SO4终止后，产物由蓝色 呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA] 经HRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量（定量）或放射自显影（定性）。 ;3.2　AP的底物 对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP) 产物为黄色的对硝基酚， 在405nm波长处有吸收峰。 用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间 磷酸4-甲基伞酮 可发荧光的底物，用于ELISA作荧光测定，敏感度较高;洗涤液 在板式ELISA中，常用的洗涤液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液。 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸， 在板式ELISA中一般采用2mol/L;ELISA的类型;抗体; 此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原， 不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能 形成两位点夹心。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子 （RF）的干扰。采用F（ab‘）或Fab片段作酶结合物 的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。 抗体的选择：如抗体的来源为抗血清，包被和 酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。;二）间接法测抗体;主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓 度的非特异性IgG ，非特异IgG可直接吸附到固相 载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。 在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（BSA） 再包被一次，以封闭（blocki