基因克隆表达资料.ppt

基因克隆技术 ;基因克隆的技术路线 目的基因 载体 ;;载体（vector）：携带外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 ;二、克隆载体;;;三、受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性;四、体外重组的策略 1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 最方便简单 高背景-载体自身环化 双向插入;2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略 粘-粘连接：最有效、最快捷 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平;2、平末端连接： 酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA 效率低，酶用量大;3、人工接头连接 人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段 ;4、T-A克隆 T-vector两条链的5’端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A ;五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 1、直接分离 3、构建cDNA文库 4、PCR 5、人工合成 6、差异显示;1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库;2、构建基因组文库，筛选目的基因 基因组文库(gene library)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。;构建流程;特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况;3、构建cDNA文库，筛选目的基因 cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。;cDNA文库仅包含正在表达的基因 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 基因总量少，易筛选;4、PCR扩增目的基因片段 适用于克隆序列清楚的基因 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法;5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因;（二）体外重组 连接体系的建立： 温度：粘末端连接：12-18℃ 平末端连接：室温（低于30℃) DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3 酶量：平端连接时需加大酶量;（三）转化—Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑） 原位杂交 2、鉴定： 长度鉴定：酶切、PCR 方向鉴定：联合酶切 测序;基因的表达 Gene Expression ;一．表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。 ;;据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。;二．原核生物基因结构和表达特点 ;原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 ;3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 ; 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 ;;5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子 ;启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区： ;RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 ;终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 ;6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点 转译起始密码子AUG 或GUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚