分子生物学实验一.pptVIP

实验一、基因组DNA的提取 ;一、实验目的： 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理。 2.掌握DNA提取的方法和步骤。 ;二、一般原理 提取DNA的一般原理，是将分散好的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。;三、材料 植物组织 四、设备  移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管。 　　 　　 　　 ; 五、试剂 1、提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 　　2、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 3、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 　　 　　 ; 六、操作步骤 1. 在1.5ml离心管中加入500μl提取缓冲液, 60℃水浴预热。 　　2. 植物组织0.1g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 　　3. 加入500μl氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 　　; 4. 室温下10000rpm离心2分钟。 　　5. 仔细移取上清液至另一1.5ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 　　6. 10000rpm离心2分钟, 去异丙醇上清液，（70%酒精洗涤，10000rpm离心2min，沉淀干燥，20μl 的TE溶解即可） 　　 ;沉淀干燥，加入200μl TE使其溶解。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 7. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的1.5ml离心管。 　　9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 　　10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 　　　 ;　 11. 10000rpm离心2分钟, 去乙醇上清液，沉淀用70%乙醇漂洗；再10000rpm离心2分钟，沉淀干燥去干净乙醇。 　　12. 将DNA重溶解于30μl TE, -20℃贮存。 　　13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取20μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。;七、DNA的紫外分光光度计检测;思考题: 　　1. 为什么构建DNA文库时,一定要用大分子DNA？ 　　2. 如何检测和保证DNA的质量？