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表达载体应具备的条件：1载体能够独立复制，有复制起点（2）应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。（3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。（6）所产生的mRNA必须有翻译的起始信号。 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素？外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率 表达产物的稳定性 细胞的代谢负荷 工程菌的培养条件 基因工程药物的分离纯化？胞内产物：细胞破碎→固液分离→包含体→变性→复性→浓缩→初步分离→高度纯化→制剂→产品 胞外产物，直接经过浓缩→初步分离→高度纯化→制剂→产品。 蛋白质工程的主要步骤通常包括*：1从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构；（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白质的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用 生物技术药物的特征分子结构复杂 具有种属特异性 治疗针对性强、疗效高 稳定性差 基因稳定性 免疫原性 内的半衰期短 受体效应 多效性和网络性效应 检验的特殊性 基因工程克隆载体的特点：1有复制子②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点③有选择性遗传标记如抗性基因④拷贝数高⑤生物安全性好 真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件⑴载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌 RNA聚合酶所识别。⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译 基因工程生产药物的优点1收获量大，更有效服务社会。2.生产效率更高3.进一步改良药理活性， 4.有利于获得新药：筛选新型化合物 目的基因的获得1. 构建cDNA文库，然后从中调用目的基因；2. 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因片段；3. RT-PCR 反转录-PCR 合成目的DNA片段4. 对旧基因的改造5. 化学合成（短）基因 宿主菌的必要条件:1. 具有高浓度、高产量、高产率2. 利用廉价原料3. 不致病、不产生内毒素4. 发热量低、需氧低、发酵温度适当.5 易于代谢调控6. 易于DNA重组7. 产物分离纯化简单 影响目的基因在E.coli表达的5大因素1基因的剂量2.表达效率3.表达产物的稳定性:4.宿主E.coli的代谢负荷5.工程菌的培养条件 影响目的基因在酵母表达的因素1外源基因的剂量2.外源基因的表达效率3.外源蛋白质的糖基化4.宿主菌株的影响 提高质粒稳定性的方法选择合适的宿主菌 固定化 选择压力 分阶段控制培养 控制/优化培养条件 选择合适的载体 最佳化工艺的综合指标最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。 高密度发酵的意义降低生产成本、提高生产效率，提高发酵罐内的菌体密度，提高产物的细胞水平量，相应的减少了生物反应器的体积，提高单位体积设备生产能力，降低生物量的分离费用，缩短生产周期。 基因工程药物或生物技术产品特点:1目的产物在初始原料中的含量较低; 2 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等 3 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感,容易失活、变性； 4 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质； 5 应用面广，对其质量、纯度要求高甚至要求无菌、无热源。 离体培养的细胞分为两类1贴壁细胞：细胞生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。2、悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。细胞为圆形。3、兼性贴壁细胞：生长不严格依赖支持物。形态：上皮样，成纤维样，圆形 贴壁培养优点：A 容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表 面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。B 容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度的目的，因细胞固定表面，不需过滤系统。C 当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一