NRCF动态蛋白组学测定、生物信息学分析和其功能的初步实验研究.pdf

摘要 NlⅪF动态蛋白组学测定、生物信息学分析及其功能 的初步实验研究 博士研究生：李广帅 导 师：董明敏李青峰 郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉一头颈外科 河南郑州450052 摘要 nerve 周围神经损伤 p甜pheraliIlj嘶es，PNI ，是一类高发生率、高致残性 的常见创伤，其发生的常见原因为意外伤害、疾病或者需要分离周围神经到达 毗邻手术部位的外科操作等。对周围神经损伤处理不当，可引起其部分或全部 功能丧失，影响患者生活质量，甚至造成患者残疾，给社会造成巨大的经济负 担。 临床工作中，周围神经损伤最常用的处理方法为断端直接缝合法和白体神 经移植术。但因神经功能束的错位、吻合口瘢痕等，疗效难以进一步提高，并 可造成供区的继发性损伤。因此，周围神经拟生态结构再生成为了机理研究的 重要方向，也是对周围神经再生研究的新思路。研究表明，周围神经再生依赖 于具备自我调控、自我完善机制的微环境。目前，基于神经再生室 nerve regenerationcha“1bers，NRc 修复为核心的，综合应用功能细胞植入及基因治疗等 多种措施的生物学治疗方法，取得了突破性进展，是周围神经再生研究的方向。 20世纪80年代，L吼dbo嬉G和他的合作者采用了圆筒状NRc模型成功修 复了大鼠周围神经的离断缺损，从而成为研究周围神经损伤的标准动物模型。 GNRc模型的管腔材料、管腔内容物、可溶性调节成 此后，研究者对Lundborg 分和功能细胞等进行了相关研究。NRc模型所提供的封闭微环境是研究周围神 conditioned 经再生的重要窗口。而神经再生条件液 nerveregeneration nuid， NRCF 是NRc模型中自神经断端分泌的功能性液体，其来源于周围神经的组 成细胞，或经轴突顺向转运、逆向弥散而来的物质成分，主要组成为蛋白，其 在周围神经再生不同时期的表达存在种类和数量的动态变化。研究表明，NRCF 摘要 对再生神经提供支持、营养和导向等重要作用。 周围神经损伤的修复是一个复杂的、精细的生理过程。周围神经功能性再 生取决于特定微环境和神经元自身生长能力的共同作用。相对于激活神经元自 身生长能力是其固有特性方面，对损伤所处的特定微环境研究就更为重要。神 经再生室模型 NRC 所提供的封闭微环境作为研究周围神经再生的重要窗口， 而神经再生条件液 NRCF 是NRc中的功能性成分，对其进行研究将是揭示 周围神经再生机理的重要途径。但目前，对周围神经再生的微环境因素，如细 胞外基质、神经营养因子和细胞因子等，进行了大量研究，但都是随机的、散 在的和推测的。因此，对NRCF中蛋白成分谱的描绘，可为研究微环境在周围 神经再生中的作用提供直接依据，对阐明再生机制具有重要指导意义。而蛋白 组学技术的发展为此提供了研究的方法基础。相对和绝对定量的等量异位标签 forrelative锄dabsolute isob耐ctagS 组学技术，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量，w 为目前研究NRCF中整体蛋白成分和时间差异表达的有效方式。 鉴于微环境在周围神经损伤修复中的重要作用，对其功能性成分 NRcF 进行研究将是了解周围神经再生机理的重要途径。本课题首次采用iTRAQ技术 成分做了整体的、全景的动态呈现和分析，通过比对蛋白质组数据库，对共表 达蛋白进行了生物信息学分析，发现了某些关键蛋白和周围神经再生的关系。 通过实验初步探讨了NRcF对雪旺细胞和成纤维细胞增殖的影响。并结合前期 研究成果，讨论了NRcF中不同补体成分参与周围神经再生过程的动态变化及 其意义。 第一部分NRC模型的建立、NRCF的提取及对雪旺细胞和成纤维 细胞增殖的影响 目的 典型的神经再生室D限c 模型为连接神经两断端的圆筒状硅胶或其他材质 所形成的密闭的间隙，其所提供的封闭微环境是研究周围神经再生的重要窗口， 而神经再生条件液 NRcF 是NRC模型中自神经断端分泌的功能性成分，可 对再生神经提供支持、营养和导向作用。雪旺细胞 schwann cell，sc 及成纤维 摘要 细胞 曲mblast cell，Fb 是参与周围神经再生的主要功能细胞。本部分实验采 用Lewis大鼠坐骨神经 sciatic neⅣe 建立NRC模型，提取M屺F，并采用CcK．8 法及流式细胞仪检测，探讨NRcF对雪旺细胞和成纤维细胞增殖的影响。 方法 模型、7d时提取NRCF。BCA法进行NRcF蛋白浓度测定。雪旺细胞和成纤维 细胞细胞株的传代培养。ccK-8法和流式细胞术检测NRcF对雪旺细胞和成纤 维细胞增殖的影响。 结果 NRcF为清澈、淡黄色、呈类血清样并稍粘稠的液体，浓