新质粒DNA的小量快速提取分析.pptx

质粒DNA的小量快速提取第四组：习文，石子涛，蒋勇，盛世豪质粒DNA提取是基因克隆中的常规工作，他包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒DNA的抽提过程。实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。实验原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。碱裂解法基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。质粒检测琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。质粒DNA的提取方法1.碱裂解法2.煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中,涡旋混匀。4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡3秒钟。5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。8、取20ml进行电泳检查。3.酚氯仿裂解法①从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30μg/mL）摇菌12h；收集1.5mL菌液，8000g/min离心3min，弃上清，沉淀加入200μLTE，充分混匀；加入400μL酚氯仿（1∶1体积）混合液，剧烈振动10s，混匀；12000g/min离心5min，1mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10s，12000g/min离心5min；沉淀溶于20μL的RTE溶液中，37℃水浴.②按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37℃，1h）.酶切产物10μL，10g/L琼脂糖凝胶电泳.③PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714bp.④常规制备感受态菌E.coliDH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30μ/mL）LB培养平板中，37℃培养，15h后观察筛选克隆情况.4.碱变性法5.SDS法6.羟基磷灰石层析法1.器材高压灭菌器，恒温摇床，高速离心机，微量可调式移液器，1.5mL离心管等。2.试剂1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，去离子水950mL，待溶质完全溶解后，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1000mL，121℃，1.01×105Pa高压下蒸气灭菌20分钟。2.氨苄西林：100mg/mL实验试剂和器材3.溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L