现代组织化学(新定稿 1栏 5号 ).doc

1、组织化学的基本原理及其与生物化学的基本区别？ 答：组织化学的基本原理：在组织切片或细胞涂片上加上一定的化学试剂，该试剂与组织或细胞内的拟捡成分起化学反应，形成有颜色的终末反应产物，该产物沉淀在相应成分所在的位置上，可在显微镜观察得到，用以研究糖类、脂类、蛋白质、酶类和核酸等物质在组织或细胞内的分布和含量。组织化学的基本原理：化学试剂＋拟检物质（组织切片或细胞涂片）→化学反应→反应产物沉淀（有色）（拟检物质所在之处） 组织化学与生物化学的区别在于：虽然两者都着眼于组织和细胞内的化学组成及其含量和酶的存在及其活性，但生物化学技术中通常是将组织和细胞打碎，制成匀浆，然后进行化学测定，故其定位性能差，而组织化学技术中是尽可能在组织或细胞内原位显示各种化学反应成分，故定位性能好；生物化学技术的化学反应是在试管内进行的，而组织化学技术中的化学反应通常是在组织切片或细胞涂片中进行的。 2、试述组织化学技术的基本要求:在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及其定位和定量以及代谢状态时，必须满足以下基本要求： (1) 保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定位精确，如果形态结构破坏而失真，则定位困难。(2) 具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。(3) 具备一定的灵敏性，以便含量很少的物质也能被显示出来。(4) 生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不被溶解，定位于原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。(5) 反应产物具有稳定性，以便于重复观察。(6) 要有重复性。 3、试述免疫组化的基本原理、基本方法，列举六种以上常用的免疫组化标记物。 免疫组化的基本原理:免疫组织化学技术是立足于生物化学，特别是免疫化学的理论，立足于组织和细胞内的某些化学物质或结构成分能够作为抗原，诱导出相应的特异性抗体，在此抗体上标记上标记物，用这种带有标记物的抗体孵育组织切片或细胞涂片，结果抗体与切片或涂片中的的相应抗原特异结合，在镜下可观察到标记物的存在，借其存在的位置和数量，得以认识抗原在组织和细胞中的定位、分布和含量。 免疫组化的基本原理:利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量的研究。 免疫组织化学染色技术的基本方法：1.直接法：用标有标记物的抗体（或抗原）去直接与组织内的相应抗原（或抗体）结合。2.间接法：先用非标记的抗体（或抗原）与组织内的相应抗原（或抗体）结合后，再用标上标记物的相应抗体与上述非标记的抗体（或抗原）相对应的结合。间接法有助于增强抗原（或抗体）定位的强度和灵敏度。 常见的标记物：酶类：辣根过氧化物酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、黑曲霉菌的葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶。荧光色素类：异硫氰酸荧光素（FITC）、异硫氰酸四甲基若丹明（TRITC）、四乙基若丹明（RB200）。电子散射化合物类：锇酸、胶体金和铁蛋白。 4、原位杂交组化的基本原理及杂交反应时的注意事项，并比较其直接法与间接法异同点，原位杂交的基本步骤。 答：原位杂交组化的基本原理：在低于核酸变性温度（Tm值）20-30°C时，根据碱基互补配对原则，在适当条件下用带有标记物的、已知碱基序列的核酸探针与组织切片上具有相应序列的单链核酸（靶核酸）发生杂交反应，形成双链结构，即杂交体。然后通过相应的显示方法将这种杂交体显示出来而对相应的靶核酸进行定位，并可利用显微分光光度计或图像分析仪等进行半定量研究。原位杂交基本步骤：1.标本制备2、杂交前处理3、杂交反应4、杂交后处理5、显示。 杂交反应时的注意事项：杂交反应中必须注意的有关环节：双链DNA探针和靶DNA变性；杂交液；探针的长度与浓度；杂交温度和时间；杂交严格度。 （1）双链DNA探针和靶DNA变性：进行杂交反应时，探针和／或靶核酸都必须是单链，双链探针和／或双链靶核酸，一般通过加热变性，加热95℃，5-15 min；探针和／或靶核酸一旦变性，要马上进行杂交反应，否则解链的核酸又会重新复性；单链探针检测靶RNA不需要变性；较长单链探针局部形成双链，通过加热处理使局部双链解开以利于探针和靶核酸之间的结合。 （2）杂交液：较高浓度的盐： Na+可使杂交率增加。甲酰胺：使Tm值降低，可避免因杂交温度过高而引起的细胞形态结构的破坏以及标本脱落。硫酸葡聚糖：与水结合，减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，提高杂交率；牛血清白蛋白及载体DNA或RNA：阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合以减低背景。pH:当杂交液的pH在5～9时，杂交体的形成不受pH变化的影响，常用的杂交缓冲液的pH为6.5～7.5。 （3）探针的长度：一般应用于原位杂交的探针的最佳长度应在30～100个碱基之间