单基因病的致病基因克隆与致病基因功能研究策略资料精要.pptxVIP

单基因病的致病基因克隆与基因功能的研究策略2014级王芳芳目录基因与基因突变基因定位克隆策略基因功能研究策略基因与基因突变基因：编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位。包括编码基因（结构基因和调控基因）和非编码基因（包括rRNA基因、tRNA基因以及小RNA基因）基因突变：发生在基因内部可遗传的结构的改变。包括点突变、插入/缺失突变、动态突变等单核苷酸多态性：基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中一种在群体中的频率不小于1%的现象特殊类型的基因变通性断裂基因：人类基因组中一大半的基因有剪接后不同的异构体——可变剪接，它们的产物都有独特的功能和序列，目前无完善的命名系统假基因：与结构基因序列类似但不能翻译为功能蛋白质的基因（不能转录/不能拼接、不能翻译），与功能基因同源，为功能基因的缺陷型拷贝。基因的结构5’非翻译区：转录的调控元件如启动子、增强子、上游激活序列转录起始位点（SP）开放阅读框（ORF）：基因的编码框架，起始密码子至终止密码子终止子3’非翻译区：转录和翻译的调控元件如poly（A）元件、稳定子、IRES定位信号断裂基因真核生物的基因编码序列在DNA分子上是不连续的，被不编码的序列隔开，称为断裂基因，由外显子和内含子组成外显子基因编码区编码蛋白质的序列，出现在成熟mRNA分子上的序列序列具有很强的保守性；应用：根据已知某个或多个物种中具有特定功能的某一基因序列，利用外显子的保守性，通过同源比对的方法可以在待测物种中找到候选基因，它们很可能具有与已知基因同样的功能。内含子基因编码区内不编码蛋白质的序列无序列特异性，基因总长度主要由内含子决定内含子的相对性一个基因的内含子可能是另一个基因的外显子，同一初始转录本产生不同mRNA（可变剪接），因而一些DNA序列可编码一种以上蛋白质少数内含子突变影响蛋白质的合成外显子-内含子剪接区：影响hnRNA的剪接和mRNA的成熟，导致外显子丢失和内含子保留或在其他位置发生剪接，最常产生一个终止密码子，导致蛋白质产物缩短部分内含子对拼接有反式调控作用，突变导致该作用丧失而引起异常拼接，形成不成熟的mRNA基因突变对多肽链结构及基因表达的影响编码区：1.沉默突变或同义突变：一般为中性，有时会影响表型（密码子偏好；破坏内在的调控元件；产生或删除了一个隐秘剪切位点）2.错义突变：保守的一般为中性；非保守的影响表型3.无义突变：蛋白质合成提前终止，产生不完整的蛋白质，严重性取决于位置（5’3’）4.通读突变：可影响多肽链的性质和mRNA稳定性5.移码突变：影响取决于位置（5’3’），产生不完整的多肽链6.非移码插入/缺失：往往可容忍，关键残基缺失会影响基因功能非编码区1.内含子：一般为中性，有时会影响表型（破坏原有剪切位点或形成隐秘的剪切位点）2.非翻译区：多是中性，有时可通过影响蛋白质合成、RNA稳定性等影响转录后调节侧翼序列大部分为中性，但影响转录调控元件如启动子或增强子的突变可能影响或破坏转录过程单基因遗传病由单个基因突变所引起的遗传病，其发生基本上受一对等位基因控制，传递方式符合孟德尔遗传定律，故又称孟德尔遗传病单基因病致病基因的研究有助于明确基因功能，阐明疾病发生发展的机制，并且可能找到一些治疗靶位点，造福子孙后代单基因病的致病基因克隆策略功能克隆候选克隆定位候选克隆消减杂交克隆微阵列技术全基因组测序（WGS）与全外显子组测序（WES）功能克隆根据疾病已知的致病蛋白或氨基酸序列克隆致病基因在特殊表型的有机体，分离一定生理生化特征的蛋白质或多肽，对部分肽段进行氨基酸序列分析，反推可能的核苷酸序列，设计简并探针或引物候选克隆分析与疾病可能相关的生理生化特征以及基因的表达模式，确定候选基因，再在这些候选基因上寻找与疾病突变表型共分离的突变，从而确定致病基因从已知的人类或动物（鼠或果蝇等）的疾病基因出发寻找新的疾病基因：①寻找已知基因序列相似的DNA片段（如EST），拼接出全长基因序列，验证；②通过物种间同源比对寻找保守序列，合成探针或简并引物进行文库筛选或PCR分离定位（候选）克隆定位：常用连锁分析，在家系中寻找与疾病表型（致病基因）共遗传（连锁）的多态性DNA标记，将致病基因定位在染色体上的特定区域确定候选基因：在数据库中查找定位区域所有的已知基因、ORF、EST或cDNA序列等信息，通过生物信息学方法预测可能的候选基因测序及验证：患者中候选基因测序，寻找病理性突变，在家系及对照组进行验证基因功能分析消减杂交克隆将不同个体或不同细胞来源，即通常所指的样本方和参照方的DNA或mRNA进行杂交，两者之间的差异，如缺失或特异表达部分，因不能形成杂交体而被筛选出来，对差异显示的片段进行序列分析即得到致病基因微阵列技术检测拷贝数变异分析总结所有患者共有CNV变异区