12第十二章动物染色体工程与转基因动物要点.pptx

第十二章 动物染色体工程与转基因动物 生命科学与技术学院 陶宏征 动物染色体工程 动物染色体工程（chromosome engineering）是指人们按预先的设计、消减或替换同种或异种动物细胞染色体的技术。 第一节 多倍体动物 多倍体动物（polyploid animal）是指细胞中含有超多正常体细胞染色体组数的动物个体 自然界中动物多倍性现象比较少见。原因是： ①高等动物的远缘杂交能力很弱，这样难以形成杂种个体； ②多倍体动物高度不育，染色体异常通常会造成胚胎死亡 尽管如此，在低等脊椎动物中还是有少数多倍体动物存在，包括鱼类、两栖类和爬行类，一般都是同源多倍体。 动物多倍体育种有着重要的意义。 Triploid Grass Carp三倍体草鱼 一 多倍体动物培育 与植物多倍体育种多采用化学有道不同，多倍体动物常采用物理方法。物理方法主要包括温度休克法、水静压法、机械创伤法、辐射高盐高碱法等 （一）物理方法 1. 温度休克法 冷休克法：用0-5℃低温处理 热休克法：用30℃左右高温处理 温度休克法廉价、处理量大、易操作，但是诱导率较低。使用温度休克法诱导多倍体的关键能否成功地组织细胞分裂或卵母细胞第二极体的释放。 多用于鱼类 2. 水静压法 采用较高的水静压可移植卵母细胞第二极体的释放或细胞分裂产生多倍体。 具有诱导率高、处理时间段（3-5min）、对受精卵损伤小、成活率高等优点 该法多用于鱼类三倍体培育 （二）化学方法 化学方法是指应用某些化学药品（如秋水仙素、细胞松弛素、6-二甲基氨基嘌呤、聚乙二醇、咖啡因等）诱导多倍体。 用化学方法需注意处理的开始时间、持续时间和药物使用浓度。 化学方法在生产上不常用，因为成功率低，并且有些化学药品有毒，会对胚胎存活率产生影响，还易对生产者产生危害。 （三）生物学方法 主要指远缘杂交，利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交产下多倍体。 如四倍体个体与二倍体个体杂交产下三倍体。 二 多倍体动物鉴定 （一）染色体技术和核型分析 简单可靠、提供直接证据 （二）核仁数目的银染色法测定 单倍体细胞含一个核仁，而二倍体、三倍体和四倍体细胞分别含有二、三、四个核仁 （三）细胞核体积测量 染色体数目的倍增与细胞核体积增大是平行的。一般来说，单倍体细胞的体积只有二倍体的一般，是三倍体、四倍体的1/3、1/4左右。 通常测定红细胞的核体积来比较 （四）DNA含量测定 在同一物种内，染色体组数和DNA含量成正比例关系。 第二节 转基因动物 转基因动物（transgenic animal）是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。 一 转基因方法 （一）原核期胚胎显微注射法 通过激素使用使雌性动物超数排卵，并与雄鼠交配，取出受精卵。然后借助于显微镜将钝化的DNA溶液迅速注入受精卵的雄核内。将该受精卵移植到另外一只假受孕母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。 这种方法转入的基因长度可达数百kb，并能随机第整合在受体细胞染色体DNA上。 该方法比较经典，应用广泛、效果比较稳定 缺点是有时候会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。 （二）胚胎干细胞方法 胚胎干细胞（ES）是一种含正常二倍染色体的具有发育全能性的细胞，因此只要将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。可以通过核移植、聚合、注射法产生转基因动物。 （三）精子载体法 精子载体法是一种直接用精子作为外源DNA载体的转移方法。基本方法是：精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以进入精子头部，受精后就克发育成转基因动物。 与显微注射技术相比，具有简单、广泛适用的特点 （四）逆转录病毒感染法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，人为感染着床前或着床后的胚胎，或直接将胚胎与能释放逆转录病毒的细胞共孵育达到感染目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因DNA中。由于逆转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA上的高度整合特性，可以提高基因转移效率。 （五）卵细胞显微注射法 由于处于减数分裂中期（MII）的卵细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂的细胞，因此为逆转录病毒载体介导的基因插入提供了更大的可能性。将外源基因克隆至逆转录病毒载体，然后将其显微注射到受精前卵细胞的卵周隙，然后在体外受精，培养至囊胚期，移入假孕的雌性动物子宫内发育。 二 转基因动物的鉴定 （一）Southern分析 提取待检动物组织DNA，消化后电泳，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影检测。该方法的优点是结果可靠，但缺点是工作量大，操作繁琐。 （二）聚合酶链式反应（PCR）技术 针对目的基因设计特异性引物，以组织提取的DNA为模板进行PCR扩增，通过对扩增产物进行序列分析就可以实现转基因动物的鉴定。但是PCR方法有时会存在假阳