二甲双胍对高糖介导的成骨细胞MG63增殖与相关基因表达的影响.pdfVIP

二甲双胍对高糖介导的成骨细胞 MG63 增殖及相关基因表达的影响 中文摘要 I 二甲双胍对高糖介导的成骨细胞 MG63增殖及 相关基因表达的影响 中文摘要 随着生活水平的提高，生活方式西方化及人口老龄化，人类健康面临的慢性疾病 威胁正日益加重，其中糖尿病及其慢性并发症更是危害健康的无情杀手。已证实长期 高血糖通过多种方式引起骨代谢紊乱，如糖毒性、高渗性及晚期糖基化终产物(AGEs) 等。体外实验也表明，高浓度葡萄糖对成骨细胞的增殖、分化和矿化产生明显的抑制 作用。骨保护素(OPG)、核因子-κB 受体活化因子配体(RANKL)及核因子-κB 受体活 化因子(RANK)是近年来发现的调控破骨细胞分化激活的细胞因子，其在骨代谢中起 重要作用。在骨组织中，成骨细胞及骨髓基质细胞表达 RANKL，与破骨细胞前体细 胞或破骨细胞表面上的 RANK 结合后，促进破骨细胞的分化和激活，并抑制破骨细 胞的凋亡。由成骨细胞分泌的 OPG 可与 RANKL 结合，竞争性抑制 RANKL 与 RANK 的结合，减少破骨细胞生成，发挥抗骨质疏松的作用。 二甲双胍（metformin,MET）作为治疗糖尿病的一线药物，其通过激活 AMP 激 活蛋白激酶（activated protein kinase, AMPK）信号系统发挥降糖作用。新的研究表明 二甲双胍能够降低 1 型及 2 型糖尿病患者骨折的发生率，对骨骼产生有益影响，其具 体机制可能为二甲双胍激活 AMPK 信号通路继而引起内皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide sythase, eNOS)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表达增加，影响成骨细胞的增殖、分化和矿化过程，对骨代谢发挥一定保护 作用。本实验中我们观察高糖环境对成骨细胞增殖、分化及矿化标志物、相关基因表 达的影响，以及二甲双胍干预后相应基因表达的变化，进一步探讨在高糖环境中二甲 双胍对成骨细胞代谢的保护作用。 一、葡萄糖对成骨细胞 MG63 增殖及相关基因表达的影响 目的 探讨不同浓度葡萄糖对成骨细胞 MG63 增殖的影响及细胞相关基因表达 的变化。 中文摘要 二甲双胍对高糖介导的成骨细胞 MG63 增殖及相关基因表达的影响 II 方法 (1)以不同浓度葡萄糖(5.5、16.7、33.3、5.5/16.7、5.5/33.3mmol/L)干预细胞 MG63 为干预组，设磷酸缓冲盐溶液(PBS)为对照组，应用细胞增殖和细胞毒性检测 试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖；(2)以不同浓度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)干预细 胞 MG63 为干预组，同时设磷酸缓冲盐溶液(PBS)为对照组，应用生化分析仪检测细 胞内碱性磷酸酶(ALP)的含量；(3)以不同浓度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)干预细 胞 MG63 为干预组，同时设磷酸缓冲盐溶液(PBS)为对照组，应用 RT-PCR 检测Ⅰ型 胶原(COLⅠ)、骨钙素(OCN)、骨保护素(OPG)、核因子-κB 受体活化因子配体(RANKL) 基因的表达。 结果 (1) 收集葡萄糖作用3天后的MG63细胞株，CCK-8法检测结果显示：16.7、 33.3mmol/L 葡萄糖组抑制细胞增殖(P0.05)，且 5.5/16.7mmol/L、5.5/33.3mmol/L 葡 萄糖交替培养组抑制作用更明显(P0.01)，而 5.5mmol/L 葡萄糖浓度组无显著变化；( 2) 不同浓度葡萄糖分别干预 MG63 细胞 6、12、18 天后，检测细胞内 ALP 的活性，结 果显示：16.7、33.3mmol/L 葡萄糖组细胞表达 ALP 均降低(P0.05)，尤其在第 6、12 天时，33.3mmol/L 组变化较显著(P0.01)；(3) RT-PCR 结果显示：16.7、33.3mmol/L 葡萄糖组 OPG、OCN 表达下调(P0.05)，尤其在 33.3mmol/L 浓度时更显著(P0.01)； 而 RANKL 在 33.3mmol/L 时表达上调(P0.05)，COLⅠ无明显变化(P0.05)。 结论 高糖及波动性高糖明显抑制成骨细胞增殖，高糖环境可下调成骨细胞内 ALP 活性、OCN 基因的表达，表明高糖可减少成骨细胞数量，同时减缓成骨细胞基 质成熟、矿化，从多个阶段减弱成骨细胞的成骨能力。进一步的实验结果显示