第14章基因重组和基因工程课件.pptVIP

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第14章  二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学 一、自然界DNA重组和基因转移 内 容 DNA重组 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 转 座 (transposition) 同源重组 (homologous recombination) 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。 一、同源重组 Holiday中间体 5′ 片段重组体 拼接重组体 二、细菌的基因转移与重组 （一）接合（conjugation） 质粒 （二）转化（transformation) （三）转导(transduction) 插入序列（IS因子） 特征： 很小的DNA片段 末端具有倒置重复序列 10 三、DNA的转座 转座作用的机制 限制性内切酶切开靶序列 转座子插入，形成具有单链粘性末端的转座子 修补缺刻，形成直接重复序列。 分为复制型和非复制型两大类 遗传效应 引起插入突变，可导致基因表达失活。 产生新的基因。 产生的染色体畸变，引起DNA缺失或倒位。 引起的生物进化，可产生新的生物学功能的基因。  二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学 一、自然界DNA重组和基因转移 内 容 限制性核酸内切酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 常用的工具酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 Bam HⅠ + HindⅡ + HO 5’ 3’ 3’ 5’ DNA连接酶 ATP ADP 5’ 3’ 5’ 3’ 目 录 DNA连接酶(DNA ligase) 二、重组DNA技术基本原理 基因克隆过程示意图 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的获取 化学合成法 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 基因组文库 cDNA文库构建: 用噬菌体载体 克隆载体(cloning vector) 扩增DNA 表达载体(expression vector) 让DNA表达成蛋白质 （二）载体的选择和构建 载体的要求 能自主复制； 具标记，便于筛选； 有多个单一酶切位点 有一定的容量 质粒 (plasmid) Polylinker MCS: multiple cloning site Promega Invitrogen 真核表达载体示例 噬菌体 载体 粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） Bam HⅠ切割反应 T4 DNA连接酶 15oC （三）基因与载体连接 单酶切克隆 双酶切克隆 平端连接 质粒DNA：制备感受态细菌，转入 （四）重组DNA转入宿主细胞 噬菌体DNA：包装后吸附感染细菌 病毒载体：包装后感染受体细胞 抗药性 标志补救(marker rescue) 原位杂交 免疫方法 （五）重组体的筛选 α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18 原位杂交 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 （六）克隆基因的表达 原核表达体系（细菌）： 优点：培养方法简单，迅速、经济又适合大规模生产工艺，经验丰富 不足： 只用于表达cDNA 不能进行翻译后修饰 易形成不溶性包涵体 真核表达体系（酵母，昆虫细胞，哺乳细胞等）： 优点：可进行适当的修饰，蛋白可分布于胞内一定区域并积累 不足：操作麻烦，费时，不经济 基因重组 总结  二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学 一、自然界DNA重组和基因转移 内 容 一、疾病基因的发现与克隆 家族性耳聋 鼻咽癌 生物制药 生物药物现状与展望 截止到2004年2月, 美国FDA批准的生物技术药物共79种。 2005年底，美国共有1415家生物技术公司，其中329家是上市公司。全部上市公司2005年底的总市值超过4100