传代培养细胞的染色体标本的制备要点.pptVIP

传代培养细胞染色体标本的制备 原 理 在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、大小、恒定性正适合对其进行分析、研究。 因此利用人工的方法，使细胞分裂处于中期而不向后期转化，并收获细胞，经处理，制片后观察分析。 器材与试剂 培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。 试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。 器材与试剂 Hela细胞 含10%小牛血清的高糖DMEM（。。RPMI1640） 秋水仙素（5微克/毫升） 0.075MKcl 固定液（甲醇/冰乙酸3:1） 乙酸优点：乙酸具有很强的穿透性能，甚至比甲醇的穿透性要高。能使核酸沉淀，阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏。经乙酸固定的物质，还能抵消甲醇的硬化作用。缺点：不能固定细胞质蛋白，并导致染色体片段的过分膨胀，故如要形成染色体的详细结构，必须把它与甲醇或类似的化学物质一道使用，后者能使组织收缩和硬化。 甲醇作用：迅速穿透组织，沉淀蛋白质，具有脱水性。蛋白质的不可逆转的变性，使组织硬化、脱水，固缩，能迅速进入细胞。 操 作 1、细胞培养 2、秋水仙素处理：加秋水仙素20ul（ 5微克/毫升），混匀，37℃，6h。 3、收集细胞：胰酶消化细胞（方法同细胞传代---胰酶处理前用PBS洗一次），用培养液将细胞收集到离心管中，1500r/min离心，10min。 5、低渗处理：弃上清，加8ml（视细胞量多少而定） 0.075M KCl溶液，充分混匀（注意吹打不要过猛），置37℃水浴20min。 （KCl：使细胞和核膨胀，染色体松软，迅速分散。0.075M KCl：染色体轮廓清晰，可染性强，染色时间短，充分显示带型） 操 作 6、预固定 ：低渗处理后，加0.5-1 ml固定液轻轻混匀，1500r/min离心，10min。（预固定可以固定染色体结构，并使细胞慢慢脱水，防止细胞离心破裂）。 7、固定 ：弃上清，加8 ml（视细胞量多少而定）固定液，充分混匀，室温静置15min，1500r/min离心， 10min。 8、制备细胞悬液 ：弃上清，视细胞数量多少加适量固定液制成细胞悬液。 9、制片 ：取细胞悬液2-3滴，滴于冰玻片上，并迅速吹片，酒精灯火焰烤干。 10、烤片： 37℃，一周。 结 果 光镜100倍下人染色体G带照片 注意事项 胰酶消化细胞的时间一定要控制好 秋水仙素的浓度及处理时间很重要。 （或秋水仙酰胺） 低渗液的浓度与处理时间应掌握好。 固定液应临用时新鲜配制。