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Rho/ROCK信号通路介导新生大鼠神经元缺氧损伤的作用机制研究 答 辩 人 ：张 衡 专 业 ：儿 科 学 年 级 ： 2012 级 导 师 ：林 霓 阳 教 授 一、研 究 背 景 二、研 究 目 的 三、实 验 方 法 四、实 验 结 果 七、展望与不足 五、讨 论 六、结 论 汕头大学医学院 一.研究背景 新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxia ischemic encephalopathy, HIE)，是由于围生期窒息缺氧所致新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxia ischemic brain damage, HIBD）。 HIE的近期不良预后是早期新生儿死亡，远期不良预后多为脑神经损害的后遗症。后遗症常见的有发育迟缓、智力低下、痉挛性瘫痪、癫痫等。 汕头大学医学院 近年来研究发现： （1）神经元细胞骨架降解是导致缺氧缺血性脑损伤的重要环节[1]； （2）神经元细胞骨架降解受Rho及其下游效应物ROCK( Rho-associated coiled-coil kinase)的调控[2]； （3）Rho/ROCK激活可使细胞骨架肌动蛋白（F-actin）重组 ，生长锥塌陷，促进细胞凋亡，抑制神经再生[3]。 汕头大学医学院 [1] Sit ST. J Cell Sci,?2011, 124(Pt 5): 679-683. [2] Thumkeo D. Eur J Cell Biol, 2013, 92(10-11): 303-315. [3] Philip Duffy. J Neurosci, 2009, 29(48): 15266–15276. 1.Rho 现已发现的Rho家族主要成员有RhoA、RhoB、RhoC 等,其中最重要的是RhoA[4]。 Rho GDP结合形式(GDP-Rho,非活化形式) GTP结合形式(GTP-Rho,活化形式) 汕头大学医学院 [4] Thumkeo D. Eur J Cell Biol, 2013, 92(10-11): 303-315 GTPase GTP酶循环 GTP酶活化蛋白 鸟苷酸转化因子 图 1 GTP酶循环示意图 Schmandke A.Neuroscientist, 2007, 13(5): 454-469 2.ROCK Rho激酶(ROCK) 是Rho的效应剂, 分为两种亚型:ROCK-II ( ROCKα ) 和ROCK-I( ROCKβ )[5]。 ROCK ROCK-II (ROCKα) 表达于神经组织 ROCK-I ( ROCKβ)表达于非神经组织 汕头大学医学院 [5] Riento K. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4(6): 446-456. 3.法舒地尔 （1）法舒地尔是一种ROCK特异性抑制剂； （2）ROCK抑制剂法舒地尔可减轻由于氧-葡萄糖剥夺所致神经细胞损伤[6]； （3）法舒地尔已在心脑血管疾病方面批准用于临床，然而在新生儿神经细胞损伤后的保护作用尚不清楚。 [6] Ding J. Brain Behav Immun, 2009, 23(8): 1083-1088. 假设？？？ (1)Rho/ROCK信号通路是否也参与到神经元的保护作用中？ (2)如果参与其中那具体的作用机制又是什么？ (3)对于临床有什么意义? 二.研究目的 （1）以体外培养的新生大鼠神经元为研究对象； （2）观察加用ROCK抑制剂法舒地尔干预前后神经元突起长度、神经细胞蛋白表达、神经元细胞骨架F-actin等指标的变化情况； （3）证实Rho/ROCK信号通路参与神经元缺氧损伤过程的假设； （4）为临床上开发ROCK抑制剂治疗HIE提供重要的实验依据。 新生SD大鼠皮质神经元培养 正常培养 缺氧培养 对照组 缺氧组 法舒地尔组 神经元鉴定 神经元突起测量 激光扫描共聚焦 显微镜观察F-actin WB检测RhoA、 ROCK-I、ROCK-II 培养7d 干预因素 图 2 实验设计路线图 三.实验方法 （1）原代皮层神经元的分离和培养 ①新生1d SD大鼠新生鼠乙醇充分消毒，断头，分离颅骨，取出大脑，去除脑膜，取出双侧大脑皮层； ②剪碎成1mm3的组织块，然后加入2mg/ml木瓜酶（含1mg/ml DNA酶）消化7 min，随后加入10% 胎牛血清终止消化，吹打，静置，吸取上清液； ③计数后按(20-30）×106/ml种植在质量浓度为0.125g /L多聚赖氨酸包被过细胞培养板中，置37℃ 5% CO2培养箱内培养，贴壁4h后用含B27体积分数为2% neu