荧光定量PCR的原理及其应用绪论.pptVIP

荧光定量PCR的原理及其应用 分子生物学实验技术 大纲 一.原理概述 二.操作及结果分析 (一).样品制备 (二).引物及探针的设计与合成 (三).标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物 (四).通道的选择及增益的选择 (五).标准曲线的建立 (六).加样时应注意的细节 (七).阈值的选定 (八).熔解曲线分析 (九).操作流程 三.应用 (一).绝对定量分析 (二).相对定量分析及实验方案 (三).SNP检测分析 一、原理概述 1.Real-Time PCR 概论 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量 分析。 一、原理概述 2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 (1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动 录荧光强度的变化 每个循环进行一次荧光信号的收集 一、原理概述 2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 (2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设置的原则要大于样本的荧 光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，并且保证回归系数大于0.99。 (3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 次数。 一、原理概述 3.荧光定量PCR所用的荧光报告基团 (1).非特异性荧光标记： SYBR Green (2).特异性荧光标记： TaqMan探针 Molecular Beacon分子信标 一、原理概述 4.非特异性荧光染料---SYBR Green的特性 (1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 (2).SYBR Green 只有和双链DNA结合受激后才发 荧光 (3).变性时，DNA双链分开，无荧光 (4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。 SYBR Green SYBR Green 一、原理概述 4.非特异性荧光染料---SYBR Green的工作原理图解 伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBR Green不断的与新增加的基因片段结合而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。 一、原理概述 5.非特异性荧光染料SYBR Green的优缺点 优点： (1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (4).可做熔解曲线分析 (5).便宜 缺点： (1).对引物特异性要求较高 (2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其 是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出; 需要不断的优化反 应体系,降低非特异性扩增. 一、原理概述 6. TaqMan---水解型杂交探针 Ta