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重组大肠杆菌发酵番茄红素和辅酶Q10的培养基、发酵条件优化方案 培养基成分组成要素： ? 碳源：葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油、淀粉等 ? 氮源：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼水解液等 ? 碳氮比（正交试验确定合理的碳氮比） ? 无机离子（正交试验最佳的无机离子组合及比例） ? 中和剂 (种类与浓度：碳酸盐) ? 特殊生长因子 ? 其他：如番茄汁、胡萝卜汁 注（大规模发酵生产，还考虑原料的价格和来源） 一、重组大肠杆菌发酵番茄红素的培养基、发酵条件优化方案 1、 供试菌种：实验室构建并保存的产番茄红素的重组大肠杆菌。 2、预考虑的培养基： （1）斜面培养基:LB培养基（含2%琼脂） （2）种子培养基: LB培养基 LB培养基： Tryptone 10g/L 、Yeast extract 5g/L、 NaCl 10g/L PH7.4 3、初步设计的发酵培养基: 改良的SOB培养基： 在SOB培养基上，加入（葡萄糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖或它们组合增加C源)[1、2、4、5、7、8]， （K2HPO4, KH2PO4, CaCl2 ）[2、3、4、5、7] 添加番茄汁(3.6mL/L)[2]、 pH值为6.5~7.2[3、4、5]、 加入氨苄青霉素（100mg/mL）和氯霉素（50mg/mL）[10] span-20[11] 中间补料培养基:葡萄糖1.0%,硫酸铵1.0%[5]. 4、初步设计培养条件优化方案 ? 温度（生长阶段37℃或33℃、表达阶段30℃ 或28℃）[6、7] ? PH：6.5~7.2[3、4、5] ? 接种量和菌龄：1∶20(V/V) 、振荡过夜 （12-16h）[6] ? 摇瓶转数：200-250rpm[10] ? 发酵时间:根据番茄红素最大产量决定（30h左右） ? 前体物：柠檬酸盐和苹果酸盐[12] ?诱导剂(1·0mmol/LIPTG)、诱导温度（37℃）和诱 导时机（OD600为0. 6）[6] 5、番茄红素的测定： （1）番茄红素提取、鉴定： 将湿菌体用磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.5)洗涤,沉淀重悬于丙酮中 ,4℃ ,暗处浸提30min,10000r/min离心5min,吸取上清液于暗处保存。再用丙酮抽提3次,合并提取液,用分光光度计分别对所得色素样品和番茄红素标准品进行扫描,并测定样品在472nm下的吸光值。 （2）细胞干重测定： 取发酵液10mL，以10000 r/min离心10 min，收集菌体，用蒸馏水洗涤2次，于60oC烘干48 h至恒重后称重. 二、重组大肠杆菌发酵辅酶Q10的培养基、发酵条件优化方案 1、 供试菌种：实验室构建并保存的产辅酶Q10的 重组大肠杆菌。 2、预考虑的培养基[1A]： （1）斜面培养基:LB培养基（含2%琼脂） （2）种子培养基: LB培养基 LB培养基： Tryptone 10g/L 、Yeast extract 5g/L、 NaCl 10g/L PH7.4 3、初步设计的发酵培养基: 改良的2YTG培养基[2A]： 在2YTG培养基上，加入（葡萄糖[3A]、蔗糖[4A]、甘油、淀粉、麦芽糖或它们组合[3A]增加C源)， 添加玉米浆[3A] 、（或豆粉）[5A] （K2HPO4, KH2PO4,MgSO4·7H2O）[3A、5A]、 CaCl2 添加番茄汁[6A]、（或胡萝卜汁）[5A] 豆油0.05g/mL[5A] pH：7.0~7.2[3A]、 加入氨苄青霉素（100mg/mL）和氯霉素（50mg/mL） 中间补料培养基:葡萄糖[3A] +玉米浆[3A、7A]. 4、初步设计培养条件优化方案 培养方式：流加发酵[3A、8A] ? 温度（生长阶段37℃[9A]、表达阶段30℃ 或28℃） ? PH：6.5~7.2[3A、5A] ? 接种量和菌龄：2%(V/V) 振荡过夜（12~16 h）[9A] ? 摇瓶转数：200-250rpm[3A] ? 发酵时间:根据番茄红素最大产量决定 ? 前体物：茄尼醇[10A]、羟基苯甲酸[10A、11A] ?诱导剂(IPTG,200mg/mL)、诱导温度（37℃）和诱导时机（OD600为0. 6）[9A] 5、辅酶Q10 的测定： （1）辅酶Q10提取： 取15 mL发酵液以3000 r/min转速离心分离20 min，倾去上清液.菌体加入15 mL丙酮，超声波振荡0.5 h，以3000 r/min转速离心分离10min，取上清液进行HPLC分析[12A