PCR基本原理与应用-黄廷华试题.pptVIP

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 25 Taq 酶的保真性不高 5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，无3’→5’外切活性; 在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如Pfu DNA聚合酶等。 3、dNTP 的质量与浓度 在PCR反应中，dNTP应为50～200μM，浓度过低会降低PCR产物的产量 注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配 高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性 4、模板DNA 模板DNA的来源： —微生物中提取DNA —从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛 发、精斑、口腔上皮细胞 —固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系 —PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 —模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加? 5、Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 二、PCR 的反应流程 温度与时间的设置 循环次数 常见问题 1、温度与时间的设置 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃退火，然后快速升温至70～75℃延伸， 对于较短靶基因（长度100～300bp）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 ① 变性温度与时间： 一般93℃～94℃，1min足以使模板变性 若低于93℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 ② 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值－（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合 ③ 延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行 ③ 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 2、循环次数 循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30～40次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？ 在PCR反应体系中，除使用Taq DNA聚合酶，掺入少量的具有3′→5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶，如Pfu，Vent，Pwo等，错配率可降为原来的 1/10； Mg2+浓度尽可能低，但不影响DNA合成； 减少高温反应时间，这样DNA热损伤将减少； 减少循环数。 如何提高PCR扩增的特异性？ 升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性； 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会； 降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引