2015-2016高中生物专题52多聚酶链式反应扩增DNA片段课件新人教版选修1课程.pptVIP

生物选修1（人教版） 专题5　DNA和蛋白质技术　　　　　　　　　　　　 　　　　　 课题2　多聚酶链式反应扩增 DNA片段 要点突破 一、生物体内的DNA复制与PCR反应的比较 ①DNA单链有方向性，DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。 ②注意不同酶的作用：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。 ③DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。 例1 标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是(　　) A．92 ℃、50 ℃、72 ℃　　 B．72 ℃、50 ℃、92 ℃ C．50 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、50 ℃、72 ℃ 解析：当温度上升到90 ℃以上(90～96 ℃)时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃左右(40～60 ℃)时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 ℃(70～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。 答案：A ?变式训练 1．PCR技术中，引物的作用是( ) A．打开DNA双链 B．催化合成DNA子链 C．使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制 D．提供模板 解析：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，引物的作用就在于此。 答案：C 二、PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成： 1．模板DNA的变性 模板DNA经加热至95 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的DNA的双链解开，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2．模板DNA与引物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3．引物的延伸 DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为反应原料，DNA母链为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性—复性—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min，2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR扩增过程中的易错点 ①PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后是DNA单链，并未分解成单体。 ②复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。 三、PCR的实验操作 1．操作步骤 (1)按PCR反应体系的配方配制所需试剂。 (2)用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分。 (3)盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 (4)将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。 (5)将离心管放在PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。 以上过程可以概括为准备、移液、混合、离心、反应五大步。 2．实验结果与分析 (1)实验中DNA含量的测定。 ①稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品稀释了50倍 ②对照调零：以蒸馏水作空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调至零。 ③测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。 ④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。 (2)理论上DNA扩增数目的计算。 DNA扩增与DNA复制一样，呈指数扩增。若只有一个DNA为模板，则复制n次后有2n个；若一开始有a个模板，则复制n次有a×2n个DNA。 (3)DNA扩增是否成功。 检测DNA片段扩增情况可以采用上述方法，也可以采用电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。 例2 下列操作过程的叙述中错误的是(　　) A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存 C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换 解析：从冰箱中放置