现代分子生物学实验原理与技术要点.ppt

②加双蒸水至800ml，混合均匀。 ③高温高压灭菌，室温保存。 2)制作平板 材料：煤气灯或酒精灯 水平台面 1L三角瓶 铝箔纸 直径9cm的培养基 药匙 试剂 琼脂粉 步骤：①胰蛋白酶8g 酵母提取物4g 三角瓶 NaCl 8g 琼脂粉 ②铝箔纸封口，混匀，灭菌。 ③待冷却至60℃左右，分装至培养皿。 ④水平台上凝固。 ⑤倒置塑料袋中4℃保存。 注意： 1、若需要加入抗生素，待冷却至60℃ ，分装前加入。 2、直径9cm的平皿，每皿25ml为宜。 3、尽量缩短平皿开盖时间，分装的培养基很快凝固，因此操作要快。 4、凝结在盖上的水珠可能至污染，故倒转存放。 5、氨苄青霉素易失活，添加后的平皿应在数周内使用。 第二节 大肠杆菌培养 无菌操作前用70%乙醇消毒台面。 离酒精灯较近距离进行无菌操作。 开盖前和开盖后用酒精灯灼烧瓶口2至3次。 瓶口倾斜，不得垂直向上。 使用平皿时尽量去除凝结在盖子上的水珠，并不 得混淆盖子。 1、培养 1）小量液体培养 材料：接种针或小木棒 煤气灯 摇床 2mlLB液体培养基 长有细菌的平皿 步骤：①用接种针接种 烧红接种针的铂金丝 轻触平皿边缘 挑起一个菌落 灼烧试管口，开盖 将铂金丝伸进液体培养基 37℃震荡过夜 ②用小木棒接种 灼烧瓶口，取一根木棒 木棒挑起单菌落 同上 2)大量液体培养基 材料：煤气灯 摇床 少量初始菌 8mlLB液体培养基 步骤：①小量培养数小时至过夜。 ②稍微打开盛有大体积培养液的三角瓶瓶盖，灼烧瓶口。 ③打开有初始培养菌的试管口，灼烧，将初始培养菌转入大量培养基中，盖上盖子，再灼烧瓶口。 ④37℃震荡过夜。 3）菌落测定 ①在煤气灯旁用微量移液器吸培养液，转至Eppendrof管。 ②打开分光光度计，调整波长至600nm。 ③吸取未接菌的培养基至比色杯中，调整光吸收值为零。 ④取Eppendrof管内的菌液于比色杯中，测A600值。 4）平板培养 划线培养 材料：接种针、煤气灯或酒精灯、新的LA平板、菌 诱导期 对数生长期 平台期 死亡期 结果：A =0.2~1.0时为指数生长期，A ＞1.0为平台期。A =1.0为10 个/ml。 8 600 600 600 步骤：①用煤气灯将接种针烧红，轻触平板一侧，冷却。 ②用铂金丝挑去平板上的单菌落，在培养基表面划线。 ③再灼烧铂金丝，冷却。 ④与前面所划线的一部分交叉划线，以减少菌数。 ⑤重复上步骤。 ⑥37℃倒置培养过夜。 第三节 大肠杆菌菌株保存 1、平板保存 材料：新平板、圆形标签纸、牙签、封口膜或胶带、长有大肠杆菌的初始平皿 步骤：①在平板底部贴标签，做标记。 ②用牙签挑单菌落，接种到平板。 ③37℃过夜后4℃保存。 涂布培养 材料：涂布棒、新的平板、酒精灯或煤气灯、菌液 步骤：①将平板翻转过来，置于盖上，50℃干燥20至 30分钟。 ②取100ul菌液，滴于平板上。 ③用涂布棒涂布均匀。 ④37℃倒置过夜。 3、穿刺保存 材料：含0.7%琼脂的LB培养基、铂金丝、封口膜、玻璃瓶。 步骤：①玻璃瓶内装2/3培养基，灭菌，冷却。 ②接种针火焰灭菌，在培养基中冷却。 ③挑取单菌落后刺入培养基底部。 ④37度