外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测-jgh要点.pptxVIP

实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 一．实验目的 1．通过本实验掌握外源基因在原核细胞中表达的特点和方法； 2．掌握SDS的制备及其分离原理。 二．实验原理 本实验介绍一种常用的表达载体――pET载体系统。在pET系列载体中，外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶的调控，这类载体是Studier等于1990年首先构建的，后来得到很大发展。它们的典型特点是带有pBR322的大肠菌素E1 (colEl)复制区。从而赋予宿主菌氨节青霉素或卡那霉素抗性。在这些载体中，编码序列在多克隆位点插入，置于天然T7 RNA聚合酶启动子(φ10启动子)或所谓的T7 lac启动子的控制之下，后者是带有lac操纵子( larO)序列的天然T7 RNA聚合酶启动子的衍生体。lac阻抑物的结合能阻断转录起始。 将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30a表达载体（如图1）中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达，表达蛋白可经SDS检测。 SDS分离蛋白原理 组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不同，可将不同的蛋白质进行分离。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。 蛋白表达系统 大肠杆菌表达系统是目前研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力：许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工（如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等）过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 酵母表达系统 酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有对表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等真核生物的功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。 酿酒酵母在分子遗传学方面被人们认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年利用酿酒酵母成功表达了第一个外源基因干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点 具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强