第41章基因工程及蛋白质工程12总结.ppt

中英联合实验室 第六节、蛋白质工程 第七节、基因工程与蛋白质工程的应用与展望 基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。 改良动物经济性状的尝试 试图通过转移单个基因改良动物经济性状的研究，至今仍未见成功的报道，尚需对性状表现的生化代谢途径，有关基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表达、组织特异性表达等进行深入的研究。 乳腺生物反应器的研究 1987年，Gordon首次报道小鼠乳腺中表达tPA蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成功报道实例已有10多种，生产出抗胰蛋白酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白因子Ⅷ、蛋白质C等药用蛋白。 5、基因治疗 苏云金杆菌在芽孢形成过程中，菌体内可产生大量具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成，这种蛋白通常被称之为杀虫晶体蛋白或苏云金杆菌毒蛋白（Bt toxin）。Bt基因是目前抗虫转基因中应用最为广泛和成熟的一种基因。Bt对于鳞翅目某些昆虫的幼虫有特异的毒性作用。 Non-transgenics Transgenics Herbicide Resistance transgene = modified EPSP synthase or phosphinothricin-N-acetyltransferase 改善营养品质的转基因植物 The Golden Rice Story Vitamin A deficiency is a major health problem Causes blindness Influences severity of diarrhea, measles 100 million children suffer from the problem For many countries, the infrastructure doesn’t exist to deliver vitamin pills Improved vitamin A content in widely consumed crops an attractive alternative ?-Carotene Pathway Problem in Plants IPP Geranylgeranyl diphosphate Phytoene Lycopene ? -carotene (vitamin A precursor) Phytoene synthase Phytoene desaturase Lycopene-beta-cyclase ξ-carotene desaturase Problem: Rice lacks these enzymes Normal Vitamin A “Deficient” Rice 一.蛋白质工程的理论和技术基础 蛋白质结构和功能的关系 DNA重组技术和基因定点诱变等技术 二.蛋白质工程的研究内容 通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效及独立工作的能力； 通过改变蛋白质的结构顺序，提高其在极端条件(如酸、碱、热等)下的稳定性； 通过改变蛋白质的结构顺序使其便于分离纯化。 三. 蛋白质工程的目的 1) 研究蛋白质结构与功能的关系 2) 改变蛋白质的特性 3) 生产蛋白质和多肽类活性物质 提高酶的产量和创建新型酶 设计和研制新型抗体 设计和研制多肽及蛋白质类药物 设计合成全新蛋白质 四、蛋白质工程的技术原理 定点诱变(Site-directed Mutagenesis) 蛋白质的结构决定功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。在体外对某个已知基因的特定碱基进行定点改变，通过取代、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构的技术叫定点诱变。对突变基因的表达产物进行研究不仅有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，还可以改造天然蛋白质的性质。 定点诱变的优点 传统的诱变技术（如化学或物理诱变剂）处理的生物体，具有突变频率低且任何基因都可能发生突变等问题。 定点诱变技术是一种通过改变基因中的特定位置的碱基，从而改造蛋白质的技术。跟传统的诱变技术相比，具有高效、简单、目的性和重复性强等特点，是我们在实验室中改造、优化基因常用的手段 。 带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变 Kunkel法 Dut: dUTP酶 Ung:N-尿嘧啶脱糖苷酶 PCR诱变法的步骤 PCR诱变法的原理是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。 PCR定点诱变法可分为重组PCR定点诱变法和大引物诱变法两种。 重组PCR定点诱变法：该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来进行的, 操作较为繁琐。