5专题5_3血红蛋白的提取和分离程序.ppt

* 课题背景的引入。 * 各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫做全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小不同，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的分离范围。 专题5 课题3 水 分 固体物质 血液 血浆 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 两个α—肽链 两个β—肽链 四个亚铁血红素基团 思考与讨论 血液有哪些成分？ 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 血红蛋白 90% 血红蛋白的特点： 1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 ㈠.血红蛋白的提取和分离 一、基础知识 ㈡.缓冲溶液 1.作用: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH值基本保持不变的混合溶液 2.缓冲溶液的组成举例： ⑴.弱酸及其对应的盐: H2CO3 —— NaHCO3、CH3COOH —— CH3COONa ⑵.弱碱及其对应的盐: NH3。H2O —— NH4Cl ⑶.多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐: NaH2PO4 —— Na2HPO4、KH2PO4 —— K2HPO4 ㈢.分离蛋白质的方法 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 ⑴.概念： 1.凝胶色谱法（分配色谱法） ⑵.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 ⑶.凝胶色谱法的原理—分子筛效应： 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 ▲依据的特性是：蛋白质分子量的大小。 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 琼脂糖凝胶电泳示意图 ⑴.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.电泳： ⑵.电泳原理： 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 ⑶.常见电泳类型： ①琼脂糖凝胶电泳 ②聚丙稀酰胺凝胶电泳 ③SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳 迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小、形状。 电泳迁移率完全取决于分子的大小。 实践训练 2.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是( ) A.糖类化合物 B.脂质 C.蛋白质 D.核酸 3.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是( ) A.蛋白质分子所带的电荷 B.蛋白质分子的形状 C.蛋白质分子的相对质量 D.缓冲溶液的pH C A 4.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是( ) A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度 C.将酶或细胞固定在凝胶中 D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度 5.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是( ) A.使酶的活性最高 B.使蛋白质的活性最高 C.维持蛋白质所带的电荷 D.使蛋白质带上电荷 A C 二、实验操作 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 1.样品处理： ㈠.蛋白质提取和分离步骤 ㈡.凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤 思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。 ①洗涤操作： (1)红细胞的洗涤: ②洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。 柜式离心机 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 五倍体积生理盐水；低速段时间离心 磁力搅拌器 搅拌器转子 搅拌器正在工作 (2)血红蛋白的释放： 蒸馏水；甲苯 (3)分离血红蛋白溶液： 甲苯层（无色透明）； 脂溶性物质沉淀层（白色薄