蛋白质的基本实验方法概念.ppt

Western Blot Western Blot A. Sample preparation B. Electrophoresis C. Transfer of proteins and staining (Western blotting) 蛋白裂解液的制备 SDSSample SDSSDSElectrophoresis Western Blot 免疫共沉淀 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 SDS在浓缩胶运动中，Clˉ解离度大，Proˉ解离度居中，甘aaCOOˉ解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Clˉ Proˉ —COOˉ，一个Clˉ领路，—COOˉ推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。 由于胶联度小，孔径大，Proˉ受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。 当蛋白质进入分离胶时，此时Proˉ，Clˉ，甘aa 离子在PH8.8 的溶液中，Clˉ完全电离而很快到达正极，甘aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。 SDS由于Proˉ在电泳过程中，带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。 SDSSDS催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。 加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。 SDS上样量：总蛋白量 20-50ug（上样量过多使电泳条带变形） 70V，30min；110V，与待分离样品靶蛋白分子量相适应。 转膜（电转移） 印迹中常用的固相材料有NC 膜、尼龙膜、PVDF 等。 PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。 转膜 NC膜及滤纸的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液平衡5分钟以上。（注意：必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中） PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2 分钟。将其浸入1×转移缓冲液平衡5分钟以上。 转膜 缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素（或PVDF）膜上，膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。 有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成三明治形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素（或PVDF）膜上。 转膜 转膜 电流1mA-2mA/cm2，我们通常200mA-350mA，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间 Western Blot Western Blot 封闭（2h）：用蛋白溶液（如5％的脱脂奶粉或BSA）处理以封闭硝酸纤维素（或PVDF）膜上剩余的疏水结合位点。（先用0.2-0.5%丽春红预染） 一抗（过夜或2h）：只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。（反贴法） Western Blot 二抗（1h）：带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。 最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。eg：辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶 Western Blot 检测辣根过氧化物酶的方法 增强化学发光法（ECL；2min） 辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 Western Blot 必需要内参！ Western Blot 一、二抗的选择及比例 凝胶质量（气泡，脆） 电转方