实验十一从自然环境中分离纯化噬菌体要点.pptVIP

实验十 从自然环境中分离纯化噬菌体 微生物学实验—2011级 一、目的要求 学习从自然环境中分离、纯化噬菌体的基本原理。 二、基本原理 噬菌体是专性寄生物，自然界中凡是有细菌分布的地方均可以发现特异的噬菌体的存在。 噬菌体DNA（或RNA）侵入细菌细胞后进行复制、转录和一系列基因的表达并装配成噬菌体颗粒后，通过裂解宿主细胞而释放出来，可以使混浊的菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体的存在。可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，可以使噬菌体增殖、释放，从而可以分离得到特异的噬菌体。 在有宿主细胞生长的固体琼脂平板上噬菌体可以裂解细菌或限制感染细菌的生长从而形成透明的空斑，这就是噬菌斑；一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用该现象可以将分离到的噬菌体进行纯化。 1、菌种：大肠杆菌（E. coli ET12567） 2、培养基： 摇瓶装三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基10ml（1瓶/组）； 试管液体培养基(5ml) （10支/组）; 上层培养基(含琼脂0.7%，试管分装，每管5ml) （10管/组）； 底层琼脂平板(含培养基20ml，琼脂2%) （10个/组）； 含4.5ml无菌水小试管（10支/组） 3、仪器与设备： 灭菌玻璃涂棒，灭菌Tip头，过滤器（0.22μm），注射器，恒温水浴箱 。 三、实验器材 三倍浓缩牛肉膏蛋白胨 液体培养基 上层培养基 底层培养基 牛肉膏 9g/L 蛋白胨 10g/L 蛋白胨 10g/L 蛋白胨 10g/L 蛋白胨 30g/L 酵母粉 5g/L 酵母粉 5g/L 酵母粉 5g/L NaCl 15g/L NaCl 10g/L NaCl 10g/L NaCl 10g/L 琼脂 0.7% 琼脂 2% 四、实验操作步骤 （一）噬菌体的分离 制备菌悬液：平板上挑取适量E. coli接入LB摇瓶中，过夜培养制成菌悬液； 增殖培养：于10ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，加入20ml污水样品和1ml大肠杆菌菌液，37℃震荡培养12~24h； 制备裂解液：将过夜培养物2500r/min离心15min，上清液用无菌滤头过滤； 确证实验：确证滤液中含有噬菌体的存在 在含有培养基的平板上加一滴大肠杆菌悬液，用灭菌涂布器涂布均匀； 待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，置于37 ℃培养过夜；如果在滴加处形成无菌生长的透明的噬菌斑，证明滤液中含有大肠杆菌的噬菌体。 (二) 噬菌体的纯化 用接种环取一环滤液接种于0.9ml无菌水中，再加入0.1ml大肠杆菌。 取上层琼脂培养基，溶化并放置于48 ℃水浴锅中，加入以上的混合液0.2ml，立即混匀（也可先放置于水浴锅中融化，然后拿出来放置，感觉不太烫手时加混合液）。 并立即倒入底层琼脂上，铺匀，置37℃培养24h。 此法分离的单个噬菌体，其形态大小常不一致，需进一步纯化。噬菌体的纯化通常采用接种环在单个噬菌斑中刺一下，接入含有大肠杆菌的液体培养基中，37 ℃培养。 待管内的菌液完全裂解，变得澄清后，过滤菌液，就可得到纯化的噬菌体。 37℃ 过夜 37℃ 振荡培养 12-24h 37℃过夜培养 取1ml 取20ml 水样 离心收集 2500r/min 15min 上清过滤 分散滴加数滴 加0.1－0.2ml 待干 看板 取一环 加0.1ml 混匀 后取 0.2ml 立即倒平板 37℃ 培养24h 刺一下 37℃ 培养24h 澄清试管过滤 纯噬菌体 噬菌体分离和纯化的流程图 加0.1ml EP管中加0.9ml水 实验十一 噬菌体效价的测定 微生物学实验—2011级 二、基本原理 噬菌体效价：是指1ml液体中所含的活噬菌体的数量。 效价测定的方法：一般是应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，因此能够进行噬菌体的记数。 因为噬菌体斑记数方法其实际效率难以接近100%（一般偏低，因为少数活噬菌体可能未引起感染），所以为了准确的表达病毒悬液的浓度（效价或滴度），一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌体形成单位（plague-forming units，简写成pfu）表示。 一、目的要求 学习噬菌体的效价的测定。 三、实验器材 1、菌种：大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体(10-2的稀释液)。 2、培养基： LB琼脂平板(20ml培养基，2%琼脂，作底层培养基用)5个; 含琼脂培养基的试管(5ml，0.7%琼脂，作上层培养基用)5支。 3、仪器与其他用具： 含4.5ml无菌水小试