第1章分子生物学技术概念.pptVIP

  方法是分子生物学，会贯通则是最高层次（综合能力）。这就要求平时多读主流杂志的英文文献，读文献时能“读图”，更要明白其研究思路。最终能达到独立设计实验路线的能力，而实验设计本着经济、适用和熟悉的原则。 研究策略 正向遗传学：基因到功能 反向遗传学：性状到控制其的特定基因 过表达 过表达的局限 野生型，过表达，突变体研究基因功能 一、 核酸分离及其检测技术 核酸参数 1.紫外定量测定：OD260× 50 ug/ml ×稀释倍数 2. 纯度测定：OD260/ OD280=1.8（蛋白） OD260/ OD230=2.0 （盐离子） 3. DNA 的Tm 是核酸分子杂交和PCR技术的基础。 (DNA长度和复杂度， G-C含量， 盐离子强度， 变性剂) 基因组DNA Southern杂交 PCR 基因组文库 RNA提取 RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。因为RNA酶含有肽链内二硫键，使其能抵抗长时间的煮沸和温和变性剂，变性后可迅速折叠，具有很高的稳定性。该酶活性的不依赖二价阳离子激活，难以被金属离子鳌和剂（EDTA）失活。RNA酶可耐受多种处理(例如煮沸、酸、碱)而 不失活。RNase存在广泛，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液和及唾液中均存在RNA酶。目前，尚无RNA酶失活的简易办法。 抑制RNA酶活性的试剂常用的有焦碳酸二乙酯（DEPC），异硫氰酸胍(GIT)， RNA酶抑制蛋白（RNasin等 DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性，是十分有效的不可逆的RNA酶抑制剂。 4 mo1/L硫氰酸胍联合β-疏基乙醇等还原剂可以灭活RNA酶。 RNasin可以与RNA酶蛋白相结合来抑制其活性，逆转录反应中常用它来抑制可能污染的RNA酶。 抑制RNase措施 配制的试剂，用0.1% DEPC处理至少5 hr以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC，否则残留的DEPC能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。 操作时带上一次性手套和口罩; 提取环境最好干净无菌，所用器皿用0.1% DEPC-H2O处理； 试管和吸头用新的而且灭菌处理过的，最好也用0.1% DEPC-H2O处理; 所用的玻璃器皿200℃烘烤至少2 hr。 RNA提取的一般原则 去蛋白 破碎细胞 RNA与DNA 纯化RNA 纯度和完整性分析 除盐和糖类等杂质 提取RNA包括破碎细胞，用酸性酚、SDS等蛋白变性剂将RNA与蛋白分开，抑制内源的RNA酶，同时去除DNA、糖类、盐类等杂质，最后纯化出RNA等步骤。由于RNA绝大多数与蛋白质结合成核蛋白体的形式存在，所以要使蛋白质变性与RNA分离。根据DNA与RNA在不同pH下稳定性不同，使提取环境保持酸性可以防止RNA被降解。 结果 烟草叶片总RNA电泳结果 普通琼脂糖凝胶电泳图谱 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图谱 亲和层析分离mRNA 以mRNA为核心的研究路线 确定转录起始位点 转录研究 总RNA mRNA cDNA Northern blotting cDNA文库 RT-PCR 二、蛋白分离和分析技术： 层析法，电泳法 亲和层析：基于特异蛋白间互作 亲和层析是一种吸附层析，免疫亲和层析（immunoaffinity chromatography）是最常见的一种蛋白质亲和层析。珠子上结合了一种靶蛋白（抗原）的特意抗体。理想的抗体只与靶蛋白发生特异性结合（而这种结合在一定的条件下又是可逆的）。其他蛋白质都流出柱子。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 三、基因克隆基本技术 PCR/RT-PCR扩增基因 基因文库筛选基因 RT-PCR制备真核生物基因 概念 DNA文库是将某一物种基因组DNA或mRNA以克隆的方式保存在大肠杆菌中的方式。 构建cD