生物实验操作3要点.pptVIP

Contents 实验目的 实验原理 实验器材及材料 实验操作 注意事项 实验目的 1.掌握盐析沉淀法提取鸡蛋卵清蛋白的方法 2.掌握卡马斯亮蓝G250反应测定蛋白质活性的方法 实验原理 1.盐析沉淀法 蛋白质溶于水是因为蛋白质分子中的亲水基团(如－COOH、－NH2和－OH)与极性水分子相互作用，形成水化层削弱了蛋白质分子之间的作用力，使得蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大较易溶于水。中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，当加入大量的中性盐，高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 实验原理 实验原理 2.考马斯亮蓝反应 蛋白质的活性测定可采用双缩脲反应、茚三酮反应、考马斯亮蓝反应等。双缩脲反应中，除了蛋白质，二肽以上的多肽、硫酸铵也可干扰此反应，灵敏度较差；茚三酮反应虽灵敏，但与其发生显色反应的并不一定是蛋白质，还可能是一些氨基酸。考马斯亮蓝染色灵敏度高，速度快，酸性环境中其游离态呈棕红色，当与蛋白质通过疏水作用结合后成蓝色，在0.01-1.0mg蛋白质范围内，蛋白质与其染色后的吸光值A959nm成正比，可用来蛋白质定量及定性测定。 实验器材及材料 实验操作 一.卵清蛋白的提取: 1.将鸡蛋一端敲一小孔，用吸管吸取蛋白2.5毫升，加生理盐水2.5毫升得到稀释液 2.逐滴加入饱和硫酸铵溶液5毫升（边加边搅拌，防止局部浓度过高引起变形）静置10分钟，3000转每分钟离心10分，弃沉淀，取上清液。 3.再在上清液中加固体硫酸铵，至不能在溶解硫酸铵为止，静置10分钟 4. 置于离心管中以3000转每分钟离心十分钟，弃上清液，沉淀用5毫升生理盐水溶解（粗产品） 实验操作 二、标准曲线绘制 配制100ug/ml的牛血清白蛋白，按下表加入各试剂： 以1号为空白对照组，在595nm的波长下测定吸光值，以吸光值为 纵坐标（y）,浓度为横坐标（x）绘制标准曲线并得回归方程。 1号 2号 3号 4号 5号 6号 生理盐水 （ml） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 标准牛血清蛋白（ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 考马斯亮蓝 （ml） 5 5 5 5 5 5 实验操作 三.考马斯亮蓝反应 1.考马斯亮蓝溶液配制：称取考马斯亮蓝G250100mg溶于50ml 90%的乙醇，加入85%的磷酸100ml混匀，配成原液。用前取原液15ml，加蒸馏水至100ml，使其浓度为0.01%。 2.考马斯亮蓝反应：按下表加入各试剂（1号为对照组） 在595nm处进行吸光值检测，得出的数据带入随后所得标准曲线回归方程中。 待测蛋白质溶液 （ml） 生理盐水 （ml） 考马斯亮蓝 （ml） 1号 0 1.0 5 2号 0.1 0.9 5