分子上午学讨论课-Western Blot研讨.pptxVIP

课堂展示 主要内容 Western Blot（蛋白免疫印迹） 蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用 WEStern Blot 印迹法（blotting）：是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 细胞内基因表达的最终产物是蛋白质，因此检测蛋白质是研究基因表达最常用、最有效的手段之一。 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 WEStern Blot基本原理 原理：经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 与Southern Blot或Northern Blot杂交方法比较 方法 Western Blot法 Northern Blot法 Southern Blot法 电泳胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳 含有甲醛的琼脂糖凝胶 被测物 蛋白质 DNA RNA 探针 抗体 DNA或核苷酸 DNA、RNA或其它寡聚核苷酸 显色 标记的二抗 放射自显影或酶反应 X胶片显色 Wertern Blot操作流程 免疫反应 蛋白质样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和SDS结合后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 凝胶的配制及电泳 常用凝胶比例配制 分离胶（12%） 浓缩胶（4%） ddH2O 4.95ml 3.05ml Arc-Bis 6ml 0.67ml Tri-HCl 3.75ml（PH=8.8） 1.25ml（PH=6.8） 10%-SDS 150ul 50ul 10%-APS 150ul 50ul TEMED 15ul 10ul 凝胶浓度与蛋白的分离范围 凝胶浓度％ （W/V） 分离范围（KD) 3.5 5.0 100-2000 80-500 8.0 12.0 60-400 40-200 15.0 20.0 25-150 6-100 30.0 6以下 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项 做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)。 加样：两边加填充物，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散 电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能联通），将电压调到85V开始电泳，待marker出现6条带时将电压调到135V，直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳。 转膜 封闭 目的： 为了降低抗体与膜的非特异性结合 操作方法： 把膜浸泡在封闭液中，4℃轻轻摇晃过夜摇晃 注意事项： 封闭一定要达到1h以上，否则封闭时间过短会导致背景过深 免疫反应 显色反应 原理：辣根过氧化物酶在碱性条件下催化Luminol氧化，同时释放出光子，产生的光信号可用X射线片直接记录下来 蛋白质双向电泳 蛋白质组学（proteomics） 双向电泳(2DE/DIGE) 蛋白质组学 概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变化的一门科学 研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最终确定它们的功能 双向电泳（2DE）示意图 2DE图谱 双向电泳（DIGE）示意图 DIGE图谱 操作步骤 样品制备 等电聚焦 胶条平衡 SDS电泳 蛋白质检测 样品制备 双向电泳的最关键步骤之一 制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质 等电聚焦 通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。 胶条平衡 等电聚焦结束后进行SDS电泳之前需进行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS充分结合，保证SDS电泳的顺利进行 步骤：一般采用两步平衡法，用含SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT后再平衡一次