DNA提取及PCR理论20121127.pptVIP

实验二：DNA提取及PCR反应 暨南大学医学院生化系 陈万群 DNA是染色体的组成成分，遗传的物质基础 研究遗传、疾病发生的基础 研究的前提：DNA的提取 目前，提取基因组DNA的方法不仅成熟而且有多种方法可供选择，如经典的酚氯仿抽提法、不同试剂公司开发的各种DNA提取试剂盒、Chelex-100法等。 /?app.html 一、DNA提取的基本步骤 1. 材料准备 2. 细胞裂解 3. 核酸分离、纯化： 4. 核酸沉淀、溶解 经典的酚氯仿抽提法 基本过程是在EDTA及SDS一类的去污剂及蛋白酶K等的作用下破碎细胞，消化蛋白质 酚、氯仿抽提则可去除与DNA结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子。 然后通过沉淀DNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，达到纯化DNA的目的。 制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持DNA分子的完整。 EDTA可以螯合金属离子，抑制DNase的活性，防止DNA的降解。 SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：①溶解膜蛋白而破坏细胞膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。 蛋白酶K，广谱蛋白酶，在SDS、EDTA存在下保持很高的活性，可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使DNA分子尽量完整地分离出来。 酚是一种作用非常强烈的蛋白质变性剂，多在初步纯化过程中使用，能非常有效地使蛋白质变性而去除。 氯仿也是一种高效的蛋白质变性剂，特别是氯仿有强烈溶脂性，对于同时去除脂质类杂质很有好处；氯仿能将微量的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉，否则微量的酚对于后续的酶切、转化等过程都会产生不利影响；加速有机相与液相分层。 异戊醇可以减少气泡产生；有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 沉淀DNA可用2—3倍体积的乙醇或使用0.6-1倍体积的异丙醇。沉淀通常在0℃或-20℃进行，对于几个kb或更大的DNA分子而言，15-30 min的沉淀时间已经足够；对于分子较小(＜200bp)或浓度较低(＜10ng)的酶切片段，增加时间会明显提高回收率。 附实验操作步骤： （1）取200?l全血，置于1.5mL Eppendorf管中，加入450?lSTE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,100mM NaCl, pH 8.0) ，然后加入10％的SDS 70uL和20mg/mL的蛋白酶K10uL 。 （2）充分混匀后置56℃温箱中消化8－12小时至透明。 以上两步由老师于周五下午操作完成。 周六上午8点 （3）加入等体积的Tris饱和酚，缓慢混匀10分钟。 （4）12000转/分离心10分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中，加入 等体积的Tris酚:氯仿(1:1), 缓慢混匀10分钟。 （5）12000转/分离心10分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中。再加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1), 缓慢摇匀10分钟 （6）12000转/分离心10分钟。上清液转至另一干净的Eppendorf管中，加入 等体积的异丙醇或预冷的2倍体积无水乙醇沉淀DNA。 （7）12000转/分离心10分钟后，弃上清，保留DNA沉淀。 （8）加入800-1000 uL70%乙醇洗涤DNA沉淀，12000转/分离心10分钟后， 弃上清。 （9）将DNA样品置于真空干燥器干燥3分钟左右或56℃温箱烘干3-4小时，加 入适量TE缓冲液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0）溶解，置4℃备用或保存于－20℃。 实时荧光定量PCR -------Ct值的重现性 周六实验 上午8点开始 三个班 实验自始至终均是 每人做一份 实验操作步骤： （1）取200?l全血，置于1.5mL Eppendorf管中，加入450?lSTE (10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,100mM NaCl, pH 8.0) ，然后加入10％的SDS 70uL和20mg/mL的蛋白酶K 10uL 。 （2）充分混匀后置56℃温箱中消化8－12小时至透明。 以上两步由老师于周五下午操作完成。 以下步骤周六完成 （3）每人取700ul消化液入1.5ml EP管（标记好）,加入等体积的Tris饱和酚，缓慢混匀10分钟。 （4）12000rpm10分钟，上清液转至另一干净的EP管中，加入Tris酚、氯仿各350ul， 慢摇10分钟。 （5）12000rpm10分钟，上清液转至另一干净的EP管中。再加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1), 慢摇10分钟 （6）12000rpm10分钟。上清液转至另一干净的EP管中，加