细胞生物学方法研讨.pptVIP

医学细胞生物学的研究方法 显微技术 生物化学与分子生物学技术 细胞分离技术 细胞培养与细胞杂交 一、显微技术 显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。 暗视野显微镜 照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。 二、生物化学与分子生物学技术 细胞化学技术 组织化学或细胞化学染色：是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。 利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。 PCR Cycle： 三、细胞分离技术 离心技术 流式细胞术 细胞电泳 四、细胞培养与细胞杂交 细胞培养 选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术 。 细胞融合 通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交 。 细胞电泳 在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动的现象称为细胞电泳。 引起细胞电泳的电位值称为ξ电位。 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞电荷量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同，因此可用来分离不同种类的细胞。 在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的ξ电位。ξ电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。 动物细胞培养 群体培养（左）和克隆培养（右） [基本原理] 1、细胞融合的概念：在自然条件下或用人工方法使两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。 2、人工诱导方法：应用最广泛的是聚乙二醇 3、可能的作用机制：聚乙二醇可引起细胞膜中的磷脂的酰键及极性基团两者在结构上发生重排。 植物细胞培养 1、组织培养：诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植株。 2、悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。 3、原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体。 4、单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的个体。 正常淋巴细胞具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。 JEM-1011透射电子显微镜 JEOL扫描电子显微镜 图2-3 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 图片来自/ 激光共聚焦扫描显微镜 A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM. a)under bright-field; b)phase-contrast; c)DIC Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus * * 普通光学显微镜 光镜样本制作 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位最有力的工具。 荧光显微镜照片 （微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 激光共聚焦扫描显微镜 蓝色