基因工程4.基因工程工具酶试题.ppt

基因工程工具酶 生物与食品工程学院 1. 脱氧核糖核酸酶（DNase） 特征：非特异性随机水解双链或单链DNA 的内切核酸酶。 需要二价阳离子作为辅助因子 作用方式与辅助因子相关 2. 外切核酸酶 是一类能从DNA或RNA链的一端开始按顺序催化磷酸二酯键，产生单核苷酸的核酸酶。 5’→ 3’ 3’→ 5’ 两端切割 3. 限制性内切核酸酶 专一性地识别双链DNA上的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开。 生理功能：保护 基因工程功能：剪刀 3. 限制性内切核酸酶 甲基化酶：使核苷酸的碱基甲基化。 甲基化酶同限制性内切核酸酶有相同的识别序列 可以用限制性内切核酸酶的名称来命名甲基化酶 3. 限制性内切核酸酶的命名 生物属名的第一个字母 生物种名的第一、二个字母 菌株代号中的一个字母 先后次序 罗马数字 3. 限制性内切核酸酶的识别序列 长度 6 二重互补对称 回文结构 可以通过电脑软件查找 3. 限制性内切核酸酶的识别序列 3. 限制性内切核酸酶切割特点 黏性末端 平末端 同尾酶 3. 限制性内切酶的一些特点 有些限制性内切核酸酶可以识别两种以上的核苷酸序列 同裂酶 不同的酶有相同的识别序列 Star活性 在特定的条件下，在不是识别序列处切割DNA 3. 限制性内切核酸酶的活性 底物纯度 分子构型 侧面序列 偏爱位点 侧面序列对切割效率会有影响 甲基化 4. 限制性内切核酸酶反应系统 酶的用量 缓冲液 反应温度 /（中文） /site/us/en/home.html /cn/home 5. 限制性图谱 DNA分子上限制性内切核酸酶识别序列的分布图。 当一种DNA分子的核苷酸序列被完全测定后，便可以绘出DNA分子上每种限制性内切核酸酶的限制性图谱。 5. 限制性图谱 双酶切法 1. 用一系列限制性内切核酸酶分别切割目的DNA分子。 2. 确定任一点为一种酶的切割位点。 3. 推断其它酶的切割位点。 5. 限制性图谱 逐步切割DNA片段法 核酸外切酶 电泳条带前移 推算 6. 末端脱氧核苷酸转移酶 功能：将脱氧核苷酸分子一个一个的加到DNA片段的3’羟基上，不依赖于模板，dNTP中的任何一种都可以作为反应的前体 利用此性质，可以给平末端DNA片段的3’羟基加上同聚物。 7. 碱性磷酸酯酶 功能：催化核酸分子脱掉5’磷酸基。 避免在DNA重组时的自我连接。 6. DNA连接酶 催化DNA分子链的相邻3’羟基与5’磷酸基团形成磷酸二酯键。 分为 1.依赖ATP 2. 依赖NAD+ 6. DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 催化双链DNA片段互补黏性末端的连接，不能催化平末端链接。 最适反应温度30℃，但为了提高氢键的稳定性，实际反应温度控制在4~15℃ ，适当延长反应时间。 6. DNA连接酶 T4DNA连接酶 既可以连接黏性末端的连接，也可以用于平末端的连接。 依赖于ATP，反应温度控制在4~15℃, 平末端需要在较高的温度下进行。 7. DNA片段的连接方法 互补黏性末端 平末端 黏性末端修饰成平末端 平末端修饰成互补的黏性末端 加衔接物或接头 8. 逆转录酶 依赖RNA的DNA合成酶 用于体外cDNA的合成 构建cDNA文库，从中筛选特异的目的基因。 9. DNA聚合酶 功能：催化以DNA单链为模板，4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成与模板链互补的DNA新链。 5’-3’ 方向的聚合酶活性 3’-5’ 外切核酸酶活性 10 RNA聚合酶 依赖DNA的RNA聚合酶 这些RNA聚合酶只能转录含有它们各自特异启动子序列的DNA，转录出相应的RNA。 11. 溶菌酶 功能：水解细菌细胞壁肽聚糖支架。 以鸡蛋清中含量最多3.4~3.5% 12. 蛋白酶 K 高活性，非特异性的蛋白水解酶，在很宽的PH范围内（4~12.5）有活性，最适PH为7.5~12对热稳定。 13. 纤维素酶 将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶 Thank You