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1花生KASⅡ和SAD基因的序列分析与表达分析 摘要: kasⅡ催化16:0-ACP到18:0-ACP，即从棕榈酸到硬脂酸转化过程的关键酶，决定16碳脂肪酸/18碳脂肪酸的比率。SAD催化的脱饱和作用是植物典型不饱和脂肪酸生物合成的第一步，在很大程度上决定了植物当中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。花生kasⅡ基因SAD基因完整编码区kasⅡ基因、SAD基因基因β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(kasⅡ)硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶(SAD)β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ是催化16:0-ACP到18:0-ACP，即从棕榈酸到硬脂酸转化过程的关键酶，决定16碳脂肪酸/18碳脂肪酸的比率。现代医学研究表明，棕榈酸对人体健康十分有害，棕榈酸摄入过多，是导致高胰岛素(Ins)血症的危险因素，可促使Ⅱ型糖尿病的发生()；棕榈酸还能增加血浆中总脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的含量，使血浆中LDL/HDL的比值增大Kratz et al., 2002)；另外棕榈酸也能降低细胞中CYP7Al的表达,使血浆胆固醇升高李燕；棕榈酸摄入过多还可导致高血压Rubba et al., 2001)。棕榈酸是脂肪酸代谢的产物之一，许多植物油当中都含有棕榈酸，随着人们健康意识的增强，减少食用油中有害脂肪酸含量，提高食用油的品质，越来越受到人们重视。分子遗传学的发展使得通过基因工程手段提高植物含油量、改善油的品质已成为可能。 目前国内外对β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ的研究已取得了一定的研究进展。已经从拟南芥、油菜等植物中获得了β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ基因的cDNA片段(Carlsson et al 2002; Slabas et al., 1992)。β-酮脂酰-ACP合成酶ⅡⅡ)在油菜种子中超表达，从而实现了油菜种子中棕榈酸合成的抑制，降低了棕榈酸的含量。 植物△9硬脂酰-ACP(酰基载体蛋白)脱饱和酶催化硬脂酰-ACP脱饱和而在脂肪酸链的C9-C10间引入一个双键形成油酰-ACP，油酰基运出质体可进一步脱饱和形成多不饱和脂酰基，这些脂酰基可形成甘油脂等，成为细胞膜的组成成分，或贮存起来成为贮脂(罗通等 2006)。由于SAD催化的脱饱和作用是植物典型不饱和脂肪酸生物合成的第一步，在很大程度上决定了植物当中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。 研究发现硬脂酰-ACP脱饱和酶具有十分重要的生理功能。首先是维持膜的生理状态并参与膜的形成。尽管植物体有许多脱饱和酶，但SAD催化的脂肪酸△9位的脱饱和而引入第一个双键对植物膜在生理温度下，由凝胶态向液晶态转化是最重要的(Los et al. 1998)。另有研究也表明SAD对于植物的低温响应也有十分重要的作用。Kodama等(1995)发现拟南芥的SAD基因突变株硬脂酸含量高，不能与对照组一样在低温下生长。为了考察低温适应中转录调节的作用, 将油菜在4℃和22 ℃下分别培养。比较两种植株和脂肪酸生物合成有关的基因的转录(mRNA)丰度, 结果表明, 低温下培养的植株一个SAD的同功基因被增量调节, 导致SAD 含量增加(Tasseva et al. 2004)。还有研究发现SAD可能与植物的防御调节有密切的关系。目前，已经在红花、蓖麻、拟南芥、油菜、芜青、黄瓜、菠菜、葡萄、芝麻、亚麻、马铃薯翼叶山牵牛等分离获得SAD的cDNA(Deborah et al., 1991; Mark et al., 1992; 范妙华等 2007；张羽航)。kasⅡ基因1．材料与方法 1.1 实验材料 选用五个不同花生品种的四种不同组织作为荧光定量分析的实验材料。五个花生品种分别为高油分的河北高油、SPI056；高油酸的E11、E16；普通品种鲁花14。对这五个品种的花生分别选取了根、茎、叶、种子四种组织作为表达研究的对象。 1.2 kasⅡ基因完整编码区序列分析用Bioxm 序列分析软件进行开放阅读框（ORF）分析，并将其翻译为相应的氨基酸序列选取不同物种的PEPCase的氨基酸序列，用Clustal X软件分析后，采用MEGA4软件建立系统进化树，进行系统进化分析。 1.荧光定量PCR(RT-PCR)分析 1 采用染料法进行RT-PCR反应，Sybr green 作为荧光燃料，以上述20个样品的cDNA为模板，上游引物和下游引物分别为Kas2-A: 5-CAGGATTGCGACCGAAGC-3和 Kas2-B: 5-GCTGGTGTGATTCTCTGCATTG-3。8s rRNA作为PCR反应的标准品。 PCR反应体系如表2-1所示：表2-1 荧光定量PCR反应体系 反应物 体积 (ul) 厂家 超纯水 36.8 Invitrogen (USA) 10*pcr buffer 5 Invitrogen (USA) 镁离子