第五章_cDNA文库的构建课程.ppt

第五章 cDNA文库的构建和筛选 以mRNA为模板反转录出的DNA称cDNA。 cDNA文库的特点 1. 基因特异性 来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息：2. 器官特异性 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。 3. 代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。 4. 不均匀性 在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。 ?5. 各cDNA均可获得表达 建立cDNA文库的一般程序 1. mRNA的分离与纯化载体DNA片段的制备。 2.双链cDNA 的合成。 1）单链cDNA 的合成：反转录法 2）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解（RNaseH） 法除去RNA分子 3. cDNA克隆载体的制备。 4. ds- cDNA与载体DNA 相连。 5. 重组cDNA分子的导入和克隆。 第一节 将RNA转变成cDNA 一、mRNA的分离纯化 总RNA的提取 RNA不稳定：核糖环上的2`－OH促使对 磷酸二酯键的亲水性攻击。 异硫氰酸胍法：异硫氰酸胍可裂解细胞，使RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。加入苯酚、氯仿，可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）为RNA，有机层（黄色）为DNA和蛋白质。 2、mRNA的分离纯化 mRNA只占总RNA的1%-5%。 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA中分离纯化。 方法： 寡聚（dT）-纤维素柱层析法。 二、cDNA合成 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligo dT。 第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。 cDNA的第一链合成 反转录：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。 禽类成髓细胞瘤病毒（AMV)的反转录酶 一类能引起鸟类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。 其反转录酶由一个α亚基和一个β亚基组成，有二种酶活力。 1）RNA指导的DNA聚合酶活力。 2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用。 莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV)的反转录酶 此酶是一条单一的多肽链，有RNA聚合酶的活性，RNaseH的活性减弱。 引物 1、Oligo dT引物 2、随机引物（六聚体寡核苷酸） 这种非特异性引物可沿着mRNA多个位点结合 3、特异性引物。 第一链合成过程 第二链合成 剩下的cDNA单链的3’末端可能形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉）。 cDNA 合成 改进 RNase H酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。 DNA聚合酶I能除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。 cDNA