1分子克隆详解.ppt

转化步骤 制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中加250 ?l Amp+250 ?l X-gal（显色底物）+25 ?l IPTG（诱导物），混匀后倒入灭菌培养皿中； 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 每组6管感受态细胞分别加DNA连接产物（4管，各10?l ）、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照，0.1?l）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； 热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒（注意：勿摇动离心管）； 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； 复苏：每管加200?l SOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏； 布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板； 培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时 即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）。 注意： 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37 ℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将?－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 电转化感受态细胞的制备（一） 前夜接种受体菌（DH5?），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）； 取1ml过夜培养物于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）； 将菌液迅速置于冰上，同时10%的甘油置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作： 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 4℃下3000g低温离心5-10分钟； 电转化感受态细胞的制备（二） 弃去上清，加入1500?l预冷的10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 4℃下3000g低温离心5-10分钟； 弃去上清，加入750?l预冷预冷的10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 4℃下3000g低温离心5-10分钟； 弃去上清，加入20?l预冷预冷的10％的甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 超低温冷冻贮存备用（－70℃）。 使用的培养基最好用NaCl减半的LB培养基； 密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制，DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 制备感受态细胞及配制试剂所用的水应达到18 MΩ，即使用超纯水；化学试剂应是分子生物学级； 所使用的枪头和器皿都应是新的、干净无菌的； 无菌操作，低温（冰上）进行。 操作注意事项——特别控制盐离子的残留 影响电转化效率的因素 细胞的生长状态非常重要，快速生长的细胞最适于制备感受态细胞； 细胞转化效率与所加电场的强度和脉冲持续时间有关。细胞上穿孔的数目和孔径大小随着所加电场的强度和脉冲持续时间的增加而增加，但超过了一定的限度，就会对细胞造成伤害。不同的细胞最适的电压不同，从450v/cm（昆虫细胞）到高于12.5 kv/ cm（细菌细胞），同时也与所使用的电转化杯有关，对于大肠杆菌而言，0.1cm的杯子使用1.8 kv（18 12.5 kv/ cm），0.2cm的杯子使用2.5kv （12.5 kv/ cm) 。时间一般设置为5毫秒。 外源分子的纯度。杂质在转化过程中会转入细胞造成不可预知的影响，且常常增加细胞的死亡率； 制备感受态细胞所用的水应达到18MΩ即使用MilliQ级的超纯水，化学试剂应是分子生物学级； 所使用的枪头和器皿都应是新的、干净的; 电转化杯的质量非常重要，随着使用次数的增加，转化效率会下降，这主要是因为铝的氧化会增加电路的电阻从而改变电场条件，另外转化杯没有洗干净，污染的DNA造成假阳性克隆的生长； 电击后，细胞处于非常不利的环境中，必须尽可能快的稀释转入合适培养基中让细胞复苏（30秒）。 蓝色菌落：载体自连 白色菌落：含外源片段 提高转化效率 感受态细胞的状态 质粒的质量和浓度： 一定范围内，转化效率与质粒 DNA的浓度呈正比 计算感受态细胞的转化效率 1ng DNA转化100 ?l 感受态细胞，加900 ?l SOC培养基复苏（1ng DNA/ml），然后取100 ?l 菌液涂平板(0.1ng DNA)，假设每个平板上平均长出100个克隆，则其转化效率为： 100 cfu ?0.1ng = 1000cfu /ng DNA = 1×106cfu / ?g DNA ?-peptide when combi