甲胎蛋白基因的检测讲课.pptxVIP

甲胎蛋白基因的检测 outline 实验目的 目的：通过提取肝癌病人的外周血，根据mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测。 取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者与非癌性肝病患者作为对照组。 实验方法及原理 通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成cDNA，利用qPCR技术，测定AFPmRNA的丰度。 实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过内参或者外参法可对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。 技术路线 RNA提取 用TRIzol试剂盒提取RNA TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。 RNA提取 1.细胞或组织加 Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。 2.12,000rpm离心5min，弃沉淀。 3.按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA