研4细胞培养基本技术和方法汇编.ppt

* * 第四章 细胞培养的基本技术和方法（I） 一、原代取材的基本要求 1.无菌 2.取材器械要锋利 3.及时培养：组织块1cm，尽快培养；若延时，将组织置于培养基内置冰浴或4℃冰箱24h 4.剔除与培养细胞无关的成分 5.营养充分：最好用胎牛血清，10－20％浓度 6.注意保存原代组织的相关材料及信息 二、组织材料的分离 （一）细胞悬液的分离 1.材料为血液、羊水、腹水、胸水等 2.500－1000r/min,低速离心5－10min （二）组织块的分离方法 1.机械分散法 （1）适用于纤维成分少的组织，如脑、肿瘤等 （2）多采用注射器针芯挤压法 3－5mm大小组织块 80目孔径不锈钢筛网 150目筛网 收集细胞悬液，接种培养 2.剪切分离法：将组织剪成1mm 左右培养 3 3.消化分离法： 三、原代细胞培养技术 原代培养：又叫初代培养，是从供体进行细胞 分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。 （一）组织块培养法 是将组织剪切成小块后，接种于培养瓶 进行培养。 1mm大小组织块 均匀摆放在培养瓶壁上，25ml培养瓶以20－30块为宜 翻转培养瓶，使瓶底朝上，加入少量培养基，置37℃温箱 2－4h后，将培养瓶翻转平放，静置培养 注意事项： 1.轻拿轻放，避免组织块漂起 2.第1－2天特别注意观察是否有污染 3.3－5天后换液一次 （二）消化培养法 1.按消化分离法获取细胞 2.将已滤过的消化液以800－1000r/min低速离心5min,弃上清，加培养液 3.接种于细胞培养瓶，置5％CO2温箱孵育 四、传代培养技术 （一）贴壁细胞的传代 1.吸或倒出旧培养液，PBS/Hanks液洗2-3次 2.加少许消化液，摇动培养瓶，使消化液覆盖整个细胞表面； 3.镜下观察细胞胞质回缩，细胞间隙增大时，弃消化液，加入培养基终止消化； 4.吹打细胞，混匀，细胞计数后，将细胞悬液分装至其他培养瓶中。 （二）悬浮细胞的传代 1.直接传代： 待细胞沉淀于瓶底后，吸出1/2-2/3的上清，吹打均匀后传入其他培养瓶。 2.离心传代： 将细胞及旧培养液一起转移至离心管中，800-1000r/min，离心8-10min，去上清，加新培养液，吹打均匀后传入其他培养瓶。 五、培养细胞的观察和检测技术 （一）培养细胞的常规观察 1.培养液：应为桃红色，颜色变浅变黄，说明 代谢产物堆积，需换液 2.细胞生长情况：贴壁细胞长满瓶底80％应传代 3.微生物污染：培养液变浑浊、出现漂浮物、 细胞生长缓慢等。 （2）生长状态不好的细胞： 细胞发暗、边缘不齐、折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。 4.细胞形态变化： （1）生长状态良好的细胞：透明度大、边缘整 齐、折光性强、轮廓不清。 （二）微生物污染的检测 1.真菌污染： a.培养液不混浊，在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物 b.倒置显微镜下可见纵横交错的菌丝 2.细菌污染： a.培养液短期内颜色变黄，明显混浊 b.镜下可见大量圆球状颗粒漂浮 3.支原体污染： a.细胞生长明显缓慢、胞质内颗粒增多、有中毒表现，但培养液不发生混浊。 b.相差油镜观察，可见位于细胞表面和细胞之间呈暗色微小颗粒，有类似布朗运动表现。 c.Hoechest33258染色后，荧光显微镜下可见亮绿色小点。 六、培养细胞的冻存与复苏 （一）细胞的冻存（慢冻） 1.原理 在不加任何保护剂的前提下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。但如果在培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜，可降低冰点，延缓冻结过程，提高胞膜对水的通透性，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 2.冻存液： 70％基础培养基＋20％胎牛血清＋10％DMSO 3.操作程序： （1）制作细胞悬液，离心1000r/min,5分钟 （2）用1ml冻存液混悬沉淀细胞，分装入冻存管 （3）冻存管上标明细胞名称、培养液名称和冻 存日期。 冻存管置4℃半小时 －20℃ 1小时 －80℃过夜 液氮 4.冻存过程：