第11课PCR技术及其应用.pptVIP

遗传标记 具有高度多态性 易特异扩增 扦测等位基因变异的方法简单、可靠 基因型变异发生频率的群体分布要清楚 能独立遗传 DNA多态性种类 序列多态性:HLA、线粒体DNA D-环区 扦测:探针(ASO、SSO)杂交、测序 长度多态性:VNTR(variable number of tandem repeat)位点 扦测:凝胶电泳、Souther blot DNA多态性种类 序列多态性:HLA、线粒体DNA D-环区 扦测:探针(ASO、SSO)杂交、测序 长度多态性:VNTR(variable number of tandem repeat)位点 扦测:凝胶电泳、Souther blot 短串联重复序列（STR）基因座遗传多态性 美国国家数据库推荐13个STR基因座作为法医个人识别和亲子鉴定的遗传标记 STR多态性的分析步骤 血样本 DNA 基因座特异PCR引物 PCR产物 等位基因分型标准物 非变性PAGE电泳 银染 电泳带谱鉴定分析 8个STR基因座基序序列结构 The sequence structure of the motifs at 8 STR loci 4. 采用5’ 端标记的引物进行 PCR, 产物 可用作：探针、序列分析和足迹试验 （footprinting) 5. Biotin 标记的5’端引物进行 PCR，产 物可用以非同位素检测和单链 PCR 产 物的纯化 / 4. 采用5’ 端标记的引物进行 PCR, 产物 可用作：探针、序列分析和足迹试验 （footprinting) 5. Biotin 标记的5’端引物进行 PCR，产 物可用以非同位素检测和单链 PCR 产 物的纯化 / (二)突变体和重组体的构建 特点： 1、可在基因任何地方进行点突变、插入突变 和缺失突变。 2、构建重组体不受酶切位点限制。 3、构建方便，常用重叠延伸PCR法。 (三)基因分离 1. 已知基因序列 2. 已知氨基酸序列 ( 混合oligo 引物 PCR) 3. 只知基因一端序列 (锚定PCR) 4. 未知序列 ( 反向 PCR、染色体步移) 5. 新基因(差异显示PCR、cDNA微阵列、cDNA未端快速扩增(RACE)、 cDNA消减文库) PCR产物克隆方法 1、限制性内切酶添加法 引物设计：PCR产物序列未知，采用识别8个核苷酸的的内切酶;考虑末端内切酶的切割效率。 2、PCR产物末端修饰，产生粘性末端。 含有特殊序列的PCR引物产生的PCR产物，在T4DNA聚合酶3’外切酶作用下，产生5’突出的粘性末端。 3、不依赖连接酶的克隆法 (1)PCR扩增及重叠延伸法介导连接 (2)产生5’单链突出端 PCR引物的5’端12或更多的残基只有三种dNTP组成，在只有一种dNTP（引物5’不存在)情况下， T4DNA聚合酶利用其3’?5’外切酶活性，获得5’突出端，与用同样方法获得的具有5’相互补单链突出端的载体退火，转化细菌。 4、T/A克隆法：PCR产物产生3’突出的dA，载体产物产生3’突出的dT。 (1)利用Tag聚合酶和dTTP，在酶切产生平端的载体3’端加上单个T。 (2)利用末端转移酶和双脱氧胸腺嘧啶核苷，在平端载体3’端加入单个T。 (3)商品化T载体。 5、平端克隆法：采用具有纠正功能的DNA聚合酶(Pfu和T4DNA聚合酶)处理，产生平末端。 (四)PCR 在序列分析中的应用 1、 模板 单、双链 DNA 均可使用，但单链 DNA 效果更好 单链 DNA 的制备 1). 不同分子比例的 PCR 引物 2). 先双引物 PCR，后单引物 PCR 3). 带有噬菌体启动子的 PCR 4). 采用M13载体，分离噬菌体的单链DNA 5). 单链 DNA 的分离 (电泳、柱层析等) 单链 DNA 的制备 1). 不同分子比例的 PCR 引物 2). 先双引物 PCR，后单引物 PCR 3). 带有噬菌体启动子的 PCR 4). 采用M13载体，分离噬菌体的单链DNA 5). 单链 DNA 的分离 (电泳、柱层析等) PCR 在序列分析中的应用 2、 测序类型 直接测序 先克隆后测序 3、 测序方法 常规双脱氧测序法 循环测序法 (PCR 法) 末端标记引物＋ 化学降解 PCR 在序列分析中的应用 2、 测序类型 直接测序 先克隆后测序 3、 测序方法