第七章蛋白质分离提纯.ppt

第七章 蛋白质分离纯化和表征 第一节 蛋白质的酸碱性质 两性电解质，能与酸碱反应，可解离基团主要来自侧链基团解离。P290 sidechain and pKa 蛋白质的等电点:与氨基酸比较，大小与所含酸性与碱性氨基酸数目有关。 蛋白质的等离子点：在没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出来的质子数目与质子受体结合的质子数相等时的pH isoionic point 第二节 蛋白质的分子形状和大小 MW6000-1000000 一、最低分子量：按化学组成测定：微量元素法，最低aa组成推断法。 二、利用渗透压测定分子量 利用半透膜进行测定p292 三、蛋白质的扩散和扩散系数 扩散：由高浓度向低浓度迁移的现象谓之扩散，扩散的速率可以用扩散系数来描述。 1. 扩散系数定义：当浓度梯度为一个单位时，在1s内，通过1cm2面积所扩散的溶质量。 2. 关系：D与蛋白质分子的大小、形状、溶剂的粘度有关。 可以用来测定蛋白质分子量 四. 蛋白质的沉降分析 概念：在超速离心场作用下，蛋白质分子密度大于溶剂密度时，产生沉降，沉降速率与蛋白质分子大小、密度(包装)，溶液的密度、粘度有关。利用超速离心机可以测定蛋白质的分子量，常用方法两种：沉降速率法和沉降平衡法。 1. 沉降速率法使用超速离心机(40-70w) 蛋白质在离心场中，沿旋转中心向外移动，其移动速率代表蛋白质分子的沉降速率。在离心场中，受到三种力，即离心力，浮力和摩擦力。当蛋白质以恒定速率沉降时，Ff=Fc-Fb 沉降系数：在单位离心场内，蛋白质的沉降速率是一个定值，谓之沉降系数，sedimentation coefficient, expressed as s. 沉降系数单位s表示，蛋白质、核酸的沉降系数为1x10-13-200x10-13s范围把10-13谓之一个Svedberg unit,S Hb为4.6x 10-13，即4.6S，在20度下，溶剂为水时的S谓之标准的沉降系数，记为s20.w 2. 沉降平衡法 在一定的离心力作用下，蛋白质在离心管内形成浓度梯度，通过测定一定梯度内蛋白质的浓度，计算出分子量。 式中c1，c2代表离旋转中心x1,x2的蛋白质浓度。其余同Svedberg方程。 五、凝胶过滤法测定分子量 六、SDS七、蛋白质分子的形状：利用摩擦比，即蛋白质在溶液内的摩擦系数f和理想化的非溶剂化的刚性球体的摩擦系数fG之比，可以描述蛋白质分子形状，f/ fG 1.0,则蛋白质为不对称分子或水化分子. 第三节 蛋白质的胶体性质、蛋白质沉淀 一、蛋白质的胶体性质：蛋白质分子从尺度上看，是胶体溶液。由于蛋白质分子表面亲水基团可以与水分子产生水化作用，故可在表面形成水化层；表面带电基团可以与水形成稳定的双电层，从而使溶液保持稳定。具有胶体的丁达尔现象，布朗运动、不能透过半透膜等性质。 二、蛋白质的沉淀 方法如下： 盐析—脱去水化层导致沉淀，不变性，中性盐; 有机溶剂沉淀—极性有机溶剂乙醇、丙酮等脱去水化层，降低介电常数，导致沉淀； 重金属盐—当pH大于pI时，蛋白质带负电，与重金属结合，形成不溶解的盐沉淀 生物碱及某些酸类沉淀—单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等，蛋白质在pHpI时，带正电，与酸或生物碱的带负电基团作用。 加热：变性沉淀 等电点沉淀—在等电点时，溶解度最低，因为缺乏了稳定的双电层，同时分子间作用力丧失。 第四节 蛋白质分离纯化一般原则 总目标，提高纯度，保持活性，把分离提纯过程分为前处理，粗分级分离，细分级分离 一、前处理：破碎和抽提，并把抽提液和细胞碎片分离开。 二、粗分级分离：将目标蛋白与细胞其它成分及其它蛋白分离，盐析，等电点沉淀，有机溶剂分级分离，还可以使用超滤、冷冻干燥等方法进行。 三、细分离：使用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等，还可以采用各种电泳的方法进行分离。结晶是非常好的方法，但非常困难。 就分离纯化方法而言，主要根据蛋白质的分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、与配体分子的生物学亲和力的大小等 第五节 蛋白质分离纯化方法 一、根据分子量大小 1. Dialysis and ultrafiltration Dialysis: this method can separate a solution of protein from a bathing solution by a semipermeable membrane, in which small molecules and ions can pass through the membrane to equilibrate between the protein solution and the bathing solution.与无机盐、单糖等小分子物质分开，不能将不同蛋白质分开。 U