第五课蛋白质和多肽的氨基酸序列测定技术分析.ppt

第五课蛋白质和多肽的氨基酸序列测定 蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长 链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、 卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的 一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸 序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级 结构的信息也有助于对其基因结构的研究。 目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即： ①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来； ②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。 其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有 裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍 采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。 第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色 谱进行分离分析。 本章将就蛋白质和多肽的N端、C端氨基酸序列分析 的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。 第一节 N端分析原理 一、耦 联 蛋白质和多肽的自由α—氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试 剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容 易断裂。 二、裂 解 在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的 第二个氨基酸残基暴露出自由的α—氨基，又可与PITC进行 耦联反应。 三、转 化 ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25％)中可转化 成稳定的PTH—氨基酸。 四、PTH—氨基酸的鉴定 可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及 质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色 谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确 等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广 泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C—18反 相柱进行分离。 第二节 N端蛋白质序列仪 三、气相序列仪 自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为1～2mg。1978年Tarr 等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测 定，它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合)而将蛋白质和多肽有效 地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子 生物学对蛋白质微量分析的要求，20世纪80年代初，Hewick及 Hunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型 玻璃反应室(内部体积约0.05m1)代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用 polybrene固定样品，Edamn降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式 输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列 仪具有以下明显优点： ①灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需50～100pmol； ②试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的l／10，降低了费用； ③缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。 20世纪80年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸 以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同 样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性PVDF膜的问世， 蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行 固相序列分析。 在这两种序列仪中，Edman降解后的PTH—氨基酸衍生物可及时直接 从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTH—氨基酸衍生物的定性及 定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一 用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图 4.2为标准PTH—氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在20min内将各组分 较好分离，需选择合适的色谱条件，表4.1列出了各种条件的改变导致个 别组分位置的迁移及图谱的改善。 第三节 影响N端Edman反应裂解率的因素 在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单 个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是 由于Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可 能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为95％～98 ％。因此，经过50次循环后，PTH—氨基酸分析谱中将出现较多杂峰， 影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N端第50个氨基 酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。 ①对于有些蛋白质由于含有较多的对Edman反应敏感的残基或肽键，裂 解效率将更低。 ②循环至Ser和Thr时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基 分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与Ser和Thr上的羟 基