实验三牛乳中酪蛋白的制备与鉴定学案.ppt

* 实验三 牛乳中酪蛋白的制备与鉴定 温馨提示：请将教室水浴锅打开，温度调至40℃。并将乙酸-乙酸钠缓冲液（1瓶/室）放入水浴锅内，预热至40℃。 * （1）学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。 （2）了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。 （3）验证蛋白质的双缩脲反应性质。 （4）学习和掌握蛋白质双缩脲反应的原理和方法。 一、实验目的 二、实验原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.8。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，乙醚除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 二、实验原理 两分子尿素加热到180℃左右时，生成双缩脲并放出一分子氮，双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。 二、实验原理 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应，因此该反应可用于蛋白质的定性或定量测定。 N 端 C 端 * 三、仪器和试剂 1、仪器： 恒温水浴锅、低速离心机、电子天平、酒精灯等。 2、试剂： 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.6）、1%氢氧化钠、10%乙酸、蒸馏水、无水乙醇、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸、饱和氢氧化钙、尿素、10%氢氧化钠、1%硫酸铜。 * 四、实验步骤 1、酪蛋白的制备： （1）量取10mL牛奶置于25mL刻度试管中，水浴中加热至40℃。在搅拌下慢慢加入10mL预热至40℃的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.6）。用精密试纸调pH值至4.8（可选择1%氢氧化钠或10%乙酸溶液进行调整）。40℃保温10min，使沉淀完全。 （2）将上述悬浮液冷却至室温。2000r/min离心5min，弃去上清液。 * 四、实验步骤 1、酪蛋白的制备： （3）往沉淀物中加入5mL蒸馏水，混匀后2000r/min离心5min， 弃去上清液。 （4）将洗净的沉淀物加入3mL无水乙醇，混匀后2000r/min离心5min， 弃去上清液，得酪蛋白粗制品。 （5）将沉淀物全部摊开在已称过重的滤纸上，置于25℃烘箱中烘干。 （6）准确称重，计算牛乳中酪蛋白含量（g/100mL）,并与理论含量为3.5g/100mL牛乳相比较，求出实际得率。 * 四、实验步骤 2、酪蛋白的溶解度鉴定： 取6支试管，分别加入蒸馏水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙各1mL。于每管中加入少量酪蛋白，不断摇荡，观察并记录各管中酪蛋白的溶解度。 * 四、实验步骤 3、酪蛋白的颜色反应（双缩脲反应）： 取少量尿素结晶，放入干燥的试管，微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开始硬化时停止加热，尿素放出氮，形成双缩脲。冷却后，加入1mL 10％NaOH溶液，振荡混匀，再加入数滴 1％CuSO4溶液，振荡，观察实验现象。（此步骤由教师演示。） 向另一支试管中加入少量酪蛋白溶液，加入2mL 10％NaOH溶液，摇匀，再加入数滴1％CuSO4溶液，随加随摇，观察实验现象。 * 1、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白g/10mL ×100% 2、酪蛋白得率=测定含量/理论含量×100% 3、酪蛋白溶于哪些溶液？ 4、酪蛋白的双缩脲反应分析。 五、实验结果、计算与分析 * 酪蛋白+蒸馏水+数滴1%硫酸铜 酪蛋白+10%氯化钠+数滴1%硫酸铜 酪蛋白+0.5%碳酸钠+数滴1%硫酸铜 酪蛋白+0.1mol/L氢氧化钠+数滴1%硫酸铜 酪蛋白+0.2%盐酸+数滴1%硫酸铜 酪蛋白+饱和氢氧化钙+数滴1%硫酸铜 酪蛋白+10%氢氧化钠+数滴1%硫酸铜 双缩脲+10%氢氧化钠+数滴1%硫酸铜 * 1、为什么调整溶液的pH值可以将酪蛋白沉淀出来？ 2、氨基酸是否能发生双缩脲反应？为什么？ 六、思考题