小花棘豆中毒对家兔睾丸a-甘露糖苷酶的影响-毕业论文.pptVIP

学生姓名：帕提古丽·毛拉红 学 号： 2011110206 所属学院： 动物科学学院 专 业： 动 物 医 学 班 级： 动医15-2班 指导教师： 王 帅 陈根元 小花棘豆中毒对家兔睾丸α-甘露糖苷酶的影响 目录 前言 材料与方法 结果与分析 讨论 结论 前言 小花棘豆（Oxytropis glabra DC）是疯草中棘豆属的一种，俗称马绊肠（内蒙古额济纳旗、宁夏、甘肃民勤）、醉马草（内蒙古伊克昭盟、阿拉善右旗、阿拉善左旗、陕西靖边、新疆策勒县和轮台）、绊肠草（甘肃民勤）、苦马豆（新疆莎车）等。小花棘豆的生命力顽强，在干旱荒漠地区可生长五年以上，而且其种子在土壤中保存五年以上也不丧失发芽能力，因此，在荒漠地区，它可起到防风固沙的作用。另外，小花棘豆还可供药用，具麻醉、镇静、止痛之功效，用于关节炎、牙痛、神经衰弱等疾病的治疗；从小花棘豆的根部可提取出生物碱和黄酮类化合物，并证实生物碱具有镇痛、镇静和抑制小鼠肉瘤生长的作用。然而，在其他牧草缺乏的季节，如果家畜大量采食该草，就可引起中毒甚至死亡。新疆阿克苏地区每年因采食小花棘豆中毒而死亡的家畜达5%～10%，严重时达50%，新疆的小花棘豆己成为草原3大害（风沙、盐碱、毒草）之一，其给该草分布地区的畜牧业生产造成了严重的经济损失。 小花棘豆具有不良气味，在正常情况下，家畜一般不愿采食，但当早春或旱年，由于其他牧草稀疏，而小花棘豆生长茂盛，牲畜被迫采食而中毒。自然放牧的家畜小花棘豆中毒是慢性过程，采食小花棘豆初期，动物上膘较快，中毒后异嗜小花棘豆草而不喜食别的牧草，当采食到一定量时（一般多在秋季），营养情况开始下降。各种家畜以马最易中毒，症状也最重，其次是山羊、绵羊，再次为牛，猪较迟钝。临床上表现为被毛粗乱无光，行动迟缓，厌食，四肢无力，牙齿脱落，视力减弱或失明，孕畜出现流产，难产和畸胎；并逐渐出现神经症状，贫血，衰竭，水肿及心脏衰弱，最后卧地不起而死亡。病畜体温正常或偏低，食欲正常或减少。各种家畜的症状并不完全一致。 材料与方法 1 实验材料、试剂与仪器 小花棘豆2014年9月采集于新疆克州阿合奇县色帕巴依乡，由塔里木大学动物科学学院草业科学学科组鉴定。取植株的地上部分，阴干、保存备用。 2.试验动物 雄性家兔24只，体质量（2.0±0.1） kg，购自塔里木大学动物科学学院实验站。随机分为对照组，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组，每组6只。分笼饲养，自由采食和饮水。对照组饲喂青干草，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组分别饲喂含有小花棘豆15%、30%和45%的混合干草。试验持续70 d。在攻毒后第14、35和70 d每组随机取2只家兔，剖杀后取睾丸，部分进行免疫组化染色分析，部分利用冰生理盐水制备10%组织匀浆液用于检测AMA活性，部分组织液氮保存用于检测mRNA水平表达的影响。所有解剖工具及冻存管均预先用DEPC水处理。 3. AMA在小花棘豆中毒家兔睾丸组织中分布的测定 家兔睾丸使用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋。包埋组织进行连续切片，片厚6 μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，然后按照试剂盒说明操作，其中抗体稀释比为1/100，DAB显色，使用PBS为阴性对照。常规脱水，透明，封片，光镜下观察组织病理学变化，采用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组化获得照片进行分析。 4.小花棘豆中毒家兔睾丸组织AMA在mRNA表达水平的测定4.1引物设计与合成 4.2总RNA提取与cDNA合成 其反应程序为：95℃预变性3 min， 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，反应40个循环，72℃最终延伸10 min[5]。 4.3普通PCR及基因测序 PCR反应体系见表3。其反应程序为：95℃预变性5 min， 94℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，反应30个循环，72℃最终延伸10 min。 4.4实时荧光定量PCR检测家兔睾丸组织中AMA的相对表达 其反应程序为：95℃预变性3 min， 94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，反应35～40个循环，72℃最终延伸10 min。 5.试验数据处理 实验数据用Excel处理，数据分析用SPSS 16.0中One-Way ANOVA进行单因素方差分析，差异显著时采用LSD法进行多重比较，结果用平均数±标准差表示。 结果与分析 1 AMA在家兔睾丸组织中的发布 AMA在家兔睾丸精曲小管、精直小管、间质细胞等均有分布，其中在精曲小管的分布较精直小管和间质细胞等明显。小花棘豆攻毒家兔睾丸组织中AMA染色明显