噬菌体展示技术和其通用实验技术简介概述.pptx

噬菌体展示技术及其通用实验技术简介 报告人：王东方 噬菌体展示 Phage display 1.什么是噬菌体展示 2.噬菌体展示技术的原理 5菌体展示技术在其它 3. 常用的噬菌体展示系统 4.单链丝状噬体展示在重组抗体制备中的应用 5.噬菌体展示技术应用与展望 1.什么是噬菌体展示技术？ 噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PDT)是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA则位于病毒粒子内。使大量多肽与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。 1.1噬菌体展示技术的发展 Smith 在 1985 年首次证实外源 DNA 可以插入 丝状噬 菌体基因 III 中，并与 pIII 蛋白融合展示。 Smith GP. Science 1985; 228:1315-7 1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽 Smith GP. Science.1985; 228:1315-7 1988 噬菌质粒系统 1990 抗体片段的展示 1993 展示cDNA文库 1994/1995 研发了‘phage two-hybrid’技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection 2.噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。 3.常用的噬菌体展示系统 单链丝状噬菌体展示系统 λ噬菌体展示系统 T4噬菌体展示系统 3.1 噬菌体结构 图1.噬菌体结构示意图 3.2 噬菌体的分类 因为噬菌体主要由蛋白质外壳和核酸组成，所以，可以根据蛋白质外壳或核酸的结构特点对噬菌体进行分类。 根据噬菌体蛋白结构可分为： 无尾部结构的二十面体 有尾部结构的二十面体 线状体 按照噬菌体的核酸类型分类可分为：ss RNA：噬菌体中所含的核酸是单链RNA。ds RNA：噬菌体中所含的核酸是双链RNA。ss DNA：噬菌体中所含的核酸是单链DNA。ds DNA：噬菌体中所含的核酸是双链DNA。 3.3 噬菌体侵染细菌 噬菌机理噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几百个子代噬菌体颗粒，每个子代颗粒又可感染细菌细胞，再生成几百个子代噬菌体颗粒。如此重复只需4次，一个噬菌体颗粒便可使几十亿个细菌感染而死亡。 噬菌体除了能使宿主细菌裂解死亡外，还有一些噬菌体感染细菌后，并不使细胞死亡，称为温和噬菌体，这些噬菌体感染细菌后，将其自身的基因组整合进宿主细胞的基因组，此时，这种宿主细菌称为溶原性细菌。 3.3 噬菌体侵染大肠杆菌  3.4 λ噬菌体展示系统 （1）PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分。PV有两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。 （2）D蛋白展示系统。D蛋白的参与野生型λ噬菌体头部的装配。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于展示那些可以对噬菌体装配造