02细胞生物学第二章 细胞生物学研究方法.ppt

二、细胞融合 ? 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 ? 同核体：相同基因型的细胞融合而成。 ? 异核体：不同基因型的细胞融合而成。 ? 自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 ? 诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 ? 诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。 ?单克隆抗体技术 ?正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长 期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗 体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了 单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。  一旦有了抗体就可以从事多种 研究。例如，抗体可用于蛋白质的纯化。将抗体添加到蛋白质的粗提取液中，相应的蛋白就会同抗体结合，然后一起沉淀下来。抗体还可用于许多免疫反应，以及应用于医学和临床。  一、名词: 冰冻蚀刻 细胞化学法 荧光原位杂交 细胞株与细胞系 细胞培养 原代培养 传代培养 细胞融合 密度梯度离心 酵母 （三）扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope，STM ? 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 ? 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。 ? 用途：三态(固态、液态和气态)物质均可进行观察。 扫描隧道显微镜原理 AJS08R科研型扫描探针显微镜SPM AJ-IIIa科研型原子力显微镜AFM AJ-Ia科研型扫描隧道显微镜STM 脂质体 流感病毒表面 的H9抗原 DNA 三、显微操作技术 micromanipulation technique ? 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 ? 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 第二节 生物化学与分子生物学技术 一、细胞化学技术 ? 组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些 细胞成分进行定性和定位研究。 ? （一）固定 1. 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛 和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶 类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 （二）显示方法 1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色 。用于显示糖和脱氧核糖核酸 （Feulgen反应）。 3. 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 5. 茚三酮反应：显示蛋白质。 二、免疫细胞化学 immunocytochemistry ? 根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原 进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 ? 免疫荧光法（immunofluorescent technique ）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 ? 酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method ）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。 三、显微光谱分析技术 ? 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。 ? 可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。 四、放射自显影术 ? 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 ? 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。 ? 一般用 14C和 3H标记 。常用 3H-TDR来显示DNA ，用 3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。