5第5章 核酸.ppt

讲到此处。 （二）复性 复性：变性DNA在适当条件下，两条分开的链彼此重新缔合成为双螺旋结构。 将热变性的DNA 骤然冷却时，DNA不可能复性、所以用同位素标记的双链DNA片段作为杂交的探针时，在沸水浴中加热数分钟后，要骤然在冰浴中冷却至低温，以防止复性。变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，此过程称为退火（annealing），DNA的片段越大，复性越慢。DNA的浓度越大，复性越快。在一定条件下，复性反应的速度可以Cot1／2来衡量。Co为变性DNA复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示／为时间，以秒表示，Cot1/2表示复性一半的Cot值。 复性的条件： 1、温度缓慢降低，骤冷不得恢复。 2、较短的片段恢复较快，反之较慢。 3、均一性比异质性好恢复。 4、浓度越大恢复越快。 （三）核酸的杂交 将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子。DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。 分子杂交实验基本步骤 1、将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。 2、将胶浸泡在碱（NaOH）溶液中使DNA进行变性； 3、然后将变性DNA转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性DNA）， 4、在80℃焙烤4～6 h，使DNA牢固地吸附在硝酸纤维素膜上。 5、与放射性同位素标记的变性DNA探针进行杂交。杂交须在较高的盐浓度及适当的温度(一般68℃)下进行数小时.然后洗涤，除去未杂交的标记物。 6、将硝酸纤维膜烘干后进行放射自显影。 分子杂交 思考题 （四）DNA与蛋白质复合物的结构 1、病毒 2、细菌的拟核 3、真核生物的染色体 病 毒 病毒基因组较小，通常只有几个至几十个基因。病毒颗粒（Virion）主要由核酸和蛋白质组成。有的病毒还含有脂质及糖类物质。在病毒颗粒中，核酸位于内部，蛋白质包裹着核酸，这层蛋白质外壳称为衣壳（capsid），衣壳由许多蛋白质亚基构成，称为原聚体（protom。。）。 病毒结构 细菌的拟核 虽然细菌没有真核细胞的核结构，其遗传物质也不显示真核细胞染色体的形态特征，但细菌的染色体DNA并非完全散开的，它在细胞内紧密缠绕形成致密的小体，称为拟核（uncleoid）约占细胞体积的三分之一。 细菌的拟核 染色体 真核生物的染色体就复杂得多，它具有不同层次的组装结构，压缩比达 10 000。在细胞分裂间期，基因组以染色质形式存在。染色质分为常染色质和异染色成两种。在常染色质中 DNA的压缩比为 1000～2 000，相对比较伸展主要为单拷贝基因和中等重复序列，是基因活跃表达区域，其表达受各种调节因子的调节。 真核生物染色体结构 核小体结构 染色质的基本结构单位是核小体（nucleosome）。 按照Konberg的模型，核小体是由直径为 110AX 55A的组蛋白核心和盘绕其上的 DNA所构成。核小体之间连接DNA的长度随不同核小体而略有不同，平均每个核小体重复单位约占 DNA 200 bp 。 过去一般认为蛋白质是结合于DNA的大沟之中。但是，自从1974年R．D．Kornbeng根据电镜观察和X射线衍射等资料，提出核小体的结构以后，上述结论已被否定。 核小体结构 核心由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子组成，所以是一个八聚体；DNA以左手螺旋在组蛋白核心上盘绕1．8圈，共146bp。 四、RNA的高级结构 （一）tRNA的高级结构 （二）rRNA的高级结构 （三）其他RNA的高级结构 （一）tRNA的高级结构 tRNA的二级结构都呈三叶草形，双螺旋比例较高，因此tRNA 的二级结构十分稳定。有5个部分组成： 1、氨基酸臂（amino acid arm）：有7对碱基，富含鸟嘌呤，末端为CCA，接受活化的氨基酸。 2、二氢尿嘧啶环（dihydrouracil loop）：8－12个核苷酸组成，具有两个二氢尿嘧啶。 3、反密码环（anticodon loop）：有7个核苷酸组成，环中部为反密码子，常有次黄嘌呤。 4、额外环（extra loop）：有8－18个核苷酸，不同的tRNA有不同的额外环，可作为分类的依据。 5、假尿嘧啶环－胸腺嘧啶核糖核苷环（TΨC）：有7个核苷酸组成，通过5对碱基与其他部分连接。所有的tRNA都含有此环。 tRNA的三级结构 用得到的酵母苯丙氨酸tRNA晶体，经X-ray衍射分析证明tRNA三级结构是一个倒L型。 （二）rRNA的高级结构 蛋白质生物合成是细胞代谢最复杂也是最核心的过程，其中涉及到200多种生物大分子参与作用。核糖体是蛋白质合成的工厂。按照传统的看法，rRNA是核糖体的骨架，蛋白质的肽键