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western blot lab208实验方法与一年辛酸WB经验总结 ——浙江海洋大学lab208闫允君试剂准备Tris-Hcl0.05mol/L(7.4)转膜缓冲液1TBST缓冲液210%SDS310%过硫酸铵（Aps）4.5×SDS电泳缓冲液5.（用时稀释成1x来用）20×TBS缓冲液6TBST缓冲液7native 1x电泳缓冲液（8.8）85x native样品缓冲液（buffer）9考马斯亮蓝染色液：1L10考马斯亮蓝脱色液: 1L111%溴酚蓝12SDS：分离胶和浓缩胶135%脱脂牛奶14单去污剂裂解液（裂解细胞）15蛋白buffer(师姐自己取的名)161.转膜缓冲液：3.03g Tris-base，14.41g甘氨酸，1mL10%SDS，200ml甲醇溶于去离子水中定容至1L。2.TBST缓冲液：加入lmLTween-20（Tween为一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。Tween很粘稠，吸取时剪枪头）至1Ll×TBS溶液中，混匀待用。3.10%SDS（十二烷基硫酸钠）：10g SDS溶于去离子水中定容至100ml。亲水基表面活性剂，起到助溶作用。因其易吸水，在配置时，用EP管称量SDS，配制高浓度的溶液，再稀释使用。白色或浅黄色结晶或粉末。有特殊气味。在湿热空气中分解。易溶于水，溶于热醇。熔点：180℃（分解）。SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸：蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。4.10%过硫酸铵（Aps）：0.1gAps用纯水定容1ml。提前配制好后每个EP管中1ml保存于-20°C保存，不要反复冻融，每次拿出一管，用完后就扔掉，不再保存。过硫酸铵是催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。5. 5×SDS电泳缓冲液：15.1gTris-base，94g甘氨酸，50mL10%SDS，溶于去离子水定容至1L6.20×TBS缓冲液：48.4gTris-base，160gNaCl，溶于去离子水，调节pH至7.6，定容至1L，室温贮存。（实验室买的是10×TBS成品）7. TBST缓冲液：加入lmLTween-20（Tween为一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。Tween很粘稠，吸取时剪枪头）至1Ll×TBS溶液中，混匀待用8. 1x native 缓冲液：3.0gTris(25 mmol/L), 14.4g甘氨酸(192mmol/L)定容至1L。9.5x native样品缓冲液（buffer）:10ml1M Tris-Hcl (ph=6.8, 312.5mmol/L)3.1mL50% 甘油5mL1%溴酚蓝（终浓度：0.05%）0.5mL蒸馏水（纯水）1.4 mL10.考马斯亮蓝染色液：1LR-2501.0g甲醇450mL蒸馏水（纯水）450mL冰醋酸100mL11.考马斯亮蓝脱色液: 1L甲醇100mL冰醋酸100mL蒸馏水（纯水）800mL12. 1%溴酚蓝: 1g溴酚蓝定容于100mL无水乙醇。13. SDS：分离胶和浓缩胶SDS.5%分离胶1.5molTris-Hcl2.5 mlSDS%浓缩胶1.5molTris-Hcl0.5 mlH204.845 mlH201.945 ml10% SDS100 ul10% SDS100ul30%Arc-Bis2.5 ml30%Arc-Bis0.4 ml10% AP50ul10% AP50ulTEMED5ulTEMED5ul14.5%脱脂牛奶：5g Skim milk powder, 100mL TBS.15.单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100mg/ml PMSF）：具体配制：1mol/L Tris·HCl（pH8.0）（稳定PH,对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。）2.5ml，NaCl(降低蛋白质在水中的溶解度) 0.438g，TritonX－100(溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性)（100%母液） 0.5ml，加蒸馏水至50ml。混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。16蛋白buffer(师姐自己取的名，替代单去污剂裂解液)50 mMTris·HCl