人类五个cDNA与酵母菌SIR基因特征的同源性比对.docVIP

生物化学与生物物理研究 260, 273–279 (1999) 人类五个cDNA与酵母菌SIR2基因特征的同源性比对： Sir2型蛋白（sirtuins）引起NAD代谢以及ADP-核糖蛋白转移酶的活性 Roy A.Frye 皇家A.Frye 匹兹堡V.A. 医学中心（132L），病理学系，匹兹堡大学 发表于1999年3月24日 摘要 酵母菌的Sir2蛋白调节后生沉默基因并且具有抗衰老作用，抑制rDNA的重组。研究包括cobB,一种细菌SIR2-型基因，表明它能够编码吡啶核苷酸的核苷酸转移酶。人类五个sirtuin cDNAs已经被标记。SIRT1的序列与酵母菌 Si2P具有的最大的同源性。Sirtuins 的SIRT4与SIRT5跟原核生物的Sirtuins序列有很近的亲缘性。人类第五个sirtuins在胎儿和成人的组织中很大程度的表达。大肠杆菌重组体每个cobT和cobB蛋白以二甲基苯丙咪唑为底物时，表现出微弱NAD依赖性单核糖基转移酶活性。重组大肠杆菌cobB和人类SIRT2 surtuin蛋白能引起放射性从NAD迁移到牛血清白蛋白（BSA）.人体SIRT2 sirtuin内部一个保守的组氨酸被修饰后成为酪氨酸，突变体的重组蛋白不能将辐射性从NAD迁移到BSA.这些结果表明sirtuins 的机能经由单-ADP核糖蛋白起作用。 渐成机制引起并维持染色质结构形式改变的区域称为异染色质，其基因很大程度上不表达。一些后生调控元件结构，比如具有SET区域的蛋白质和Sir2以及有色域在真核生物进化发展中高度保守（1-3）。在啤酒酵母中，Sir2p参加建立和维持异染色质型的状态，抑制位于或者临近沉默基因HM配型核仁染色质端粒位（4-6）.其他三个Sir蛋白（调节沉默信息调节物蛋白）（Sir2p，Sir3p，以及Sir4p）的功能通过控制Sir2p的分布；他们形成具有Sir2p的复杂多聚体，靶Sir2p在特殊染色质的位点（4，5，7，8）。除后生的沉默基因作用外，酵母菌的Sir2p的金贝尔依赖性机能以及双链DNA切断修复并且维持端粒（9-10）。此外，酵母菌的Sir2p抑制核仁DNA重组，这个代表一种抗衰老的机制（11-13）。 Sir2样蛋白（sirtuins）出现在原核生物以及所有的真核生物中包括哺乳动物（1）。鼠伤寒沙门氏菌的研究中，表明CobB基因（一种SIR2样基因）能够使细菌在CobT基因的功能丢失变异中幸存（14）。CobT基因编码烟酸盐单核苷酸：5，6-二甲基苯并咪唑a-磷酸基-D-核糖基）-5，6-二甲基苯并咪唑（也称作a-核糖-5’-磷酸盐），生物合成钴胺素的核苷酸环状聚合物前体（15，16）。因为CobT酶充当吡啶核苷酸转移酶以及CobB蛋白似乎能够补偿CobT的功能缺失，这样增加了CobB蛋白承担某些吡啶核苷酸转移因子的功能。 在这篇报导中，描述了五个Sir2型cDNAs，这些编码sirtuin的基因发现能够广泛表达。E.coli的CobB 的Sirtuin显示，能够削弱以5，6-二甲基苯并咪唑作为底物的NAD依赖性的ADP核糖基转移酶的活性。提纯E.coli CobB sirtuin重组体以及人类的SIRT2 sirtuin 都能使在NAD上检测到的标记物转移到牛血清白蛋白（BSA）上，并且在SIRT2中突变后残留的保守组氨酸能够废除这种反应；这种结果暗示sirtuins 有可能具有利用NAD经由ADP-核糖基修饰底物蛋白的功能。 材料和方法 人类sirtuin cDNAs的特征。啤酒酵母菌Sir2的氨基酸序列曾经被用作EST基因文库数据库的探针，以及获得人类五个不同cDNA碎片。为了更加容易的分析许多人类sirtuin cDNA EST碎片，利用“EST组装工具”以及“ETSblast”程序。SIRT1仅仅限制在EST数据库中出现的片段，这种cDNA利用Marathon AP1作为引发剂，在人类睾丸Marathon cDNA基因库中用PCR技术克隆，并且这种有意和反义引发剂在EST序列AA461259中得到。用Clontech Marathon克隆序列或者MTC cDNA中获得的高精度HF优势聚合酶验证SITR中的五条cDNA序列中的编码序列，（Clontech）或者pfu—Turbo，（Stratogene）是氧化三辛基膦TA PCR2.1带菌体亚克隆产生的扩增子（Invitrogen）。Sirtuin基因的表达图式在胎儿和成人组织中以多重组织cDNA（MTC）面板（Clontech）为特征。在这项实验中，人类sirtuin PCR引物被设计在500bp到600bp范围内产生扩增子。扩增子常常与下列cDNA序列间期相对应（正义序列，反义序列）：SIRT1（1021-1045，1559-1585）