Westernblot技术解读.pptxVIP

Western blot技术培训 许袖 技术支持 培训目的 了解相关产品，给客户推荐； 扩充知识面，提高工作效率。 原理 Western免疫印迹（Western Blot，wb） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体（根据抗原抗体反应）进行检测相应的蛋白分子。 意义和目的 操作方便，成本较低，小型迷你电泳槽即可一块胶上样8-12个，能够满足一般实验室的需求 一般无需大型的昂贵仪器，即可完成实验过程，每个实验室都可以购买1套至几套电泳仪和电泳槽 比较几个样品之间，某个蛋白的表达量高低（多少）的差异 意义和目的 Western只是实验方法， 做文章主要是看实验设计， 也就是上样的这几个样品是什么， 对照组—处理组 癌旁组织—肿瘤组织 对照（不加抑制剂和激活剂） —抑制剂A—抑制剂B—激活剂A —激活剂B —同时加抑制剂和激活剂 实验操作流程 1.相关溶液的制备 2.蛋白样品的提取和准备 3. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜 4. 免疫印记和显影 1.相关溶液的制备 ?RIPA裂解液（强）： 50 mM Tris-HCl（pH 7.5） 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1% Sodium deoxycholate（脱氧胆酸钠） 1% Triton X-100 0.1% SDS 1 mM Na3VO4 5?10 mM NaF 使用前按1:50加入Roche公司的蛋白酶抑制剂（Complete protease inhibitor ）。 ? 4×SDS上样缓冲液： ? ? ? ? ? ? ? 2.蛋白样品的提取和准备 按每25 mg组织加入500 μL RIPA裂解液，于冰上高速匀浆，静置5 min，4°C 12000 r/min离心10 min，取上清。如果是培养的细胞，则按照每35 mm皿加入130 μL RIPA裂解液，用细胞刮将细胞刮下，直接用于下一步操作。 细胞裂解液用超声仪超声10 s，4°C 12000 r/min离心5 min，取上清。可置于-70°C保存。 使用普利莱公司BCA检测试剂盒检测蛋白样品浓度。取10 μL上清，加200 μL检测试剂，以BSA作为参照绘制标准曲线，使用波长560 nm的酶标仪读出吸光值，计算出蛋白浓度。 根据测得的蛋白浓度，将各个蛋白样品用RIPA裂解液稀释至同一浓度。 加入1/3体积的4×SDS上样缓冲液，沸水煮7 min后，待点样。 3. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜 4. 免疫印记和显影 组织和细胞裂解液 CST: RIPA Buffer (10X) #9806 蛋白酶抑制剂（ Complete protease inhibitor ） 9806S RIPA Buffer (10X) 15 ml ￥727.1 北京现货 品牌 货号 描述 规格 原价格 货期 Roche 4693116001 Complete protease inhibitor 20片 3337 4周左右 Merck 539131-10VLCN Protease Inhibitor Cocktail Set I ea 3535 4周左右 Merck 539131-1VLCN Protease Inhibitor Cocktail Set I ea 462 4周左右 9803S Cell Lysis Buffer (10X) 15 ml ￥727.1 膜 NC PVDF millipore HATF00010 Immobilon-NC Membrane, Triton-free, mixed cellulose esters, 0.45μm, 33cm x3m roll 33cm x3m 1 1680 现货 Merck-Millipore ISEQ00010 Immobilon-P SQ 26.5cm x 3.75m roll PVDF EA 3606 Merck-Millipore IPVH00010 Immobilon-P 26.5 x 3.75m Roll PVDF .45um EA 3440 Millipore IPFL00010 Immobilon-FL 26.5cm x?3.75m Roll PVDF 0. ea 4155 Millipore IPFL07810 Immobilon-FL 7x8.4cm sht10pk PVDF 0.45um ea 813 Millipore IPFL10100 Immobilon-FL 10x10cm sht10pk PVDF 0.45um ea 1362 Millipore IPFL20200 Immobilon-FL 20x20cm sht10pk PVDF 0.45um ea 2871 Millipore IPSN07852