大肠埃希菌的检测详解.pptxVIP

大肠埃希菌的检测  检测意义 大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，故常来源于人和动物的粪便，所以常作为粪便污染的指标。一旦被检药物中查出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险。因此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国家药品卫生标准规定口服药品不得检出大肠埃希菌。 检测原理： 中国药典采用了MUG－Indole快速测定药品中大肠埃希菌。 在MUG试验中，将MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基中，被大肠埃希菌的β-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示系统，在366 nm紫外光下呈现兰白色荧光，即MUG阳性；若无荧光，即MUG阴性。 靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者(阳性)，报告检出大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳，需要进一步的培养和生化试验检查。 本方法对大肠埃希菌的检出率达98％。 培养温度：控制菌培养温度为30～35℃。 实训器材： 蒸汽灭菌物品： 1.乳糖胆盐发酵培养基试管10支 干热灭菌物体： 5mL移液管1支 1mL移液管5支 流程图： 甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基 胨10.0g? 硫酸锰0.5mg 硫酸锌0.5mg? 硫酸镁0.1g? 氯化钠5.0g?? 氯化钙50.0mg?? 磷酸二氢钾0.9g? 磷酸氢二钠6.2g? 亚硫酸钠40.0mg? 去氧胆酸钠1.0g?? MUG?75mg 水1000mL 除MUG外，取上述成分，混合。微温溶解，调节PH7.2-7.4，加入MUG，溶解，每管分装5mL，灭菌。 实验步骤： 取供试供试液1mL，直接或处理后接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。 取上述培养物0.2mL,接种至含5mL MUG培养基的试管内培养，于5小时，24小时在366nm紫外灯光下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。 若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，不呈现荧光，则为MUG阴性。 观察后，沿着培养管的管壁加入数滴靛基质试液，叶面呈玫瑰红色，为靛基质阳性，呈试剂本色，为靛基质阴性。 本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 靛基质实验原理 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 伊红美蓝培养基（EMB培养基） ????蛋白胨水琼脂培养基100ml，20%乳糖溶液2ml，2%伊红水溶液2ml，0.5%美蓝水溶液1ml，将已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基（pH7.6）加热溶化，冷却至60℃左右时，再把已灭菌的乳糖溶液，伊红水溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入。摇匀后，立即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌温度，115℃灭菌20min。 结果分析： 1.MUG、靛基质结果判断 MUG培养结果：在366nm紫外线下观察 靛基质结果：液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试液本色，为靛基质阴性 MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠杆菌； MUG阴性、靛基质阴性，判未检出大肠杆菌； MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性，需进一步做以下检查 2。EMB培养结果判断 EMB培养18-24h后，检查有无疑似大肠埃希菌菌落（大肠埃希菌落形态特征见表），若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验大肠埃希菌落形态特征 培养基 菌落形态 EMB 呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，微突起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。 检验依据： 2010年版?中国药典?二部附录ⅪJ 微生物限度检查法检验标准规定：口服制剂细菌数1g不得超过1000个；1ml不得超过100个。霉菌及酵母菌数1g不得超过100个。控制菌1g（1ml）不得检出大肠埃希菌。 注意事项 1．实训过程要严格无菌操作。 2．供试液稀释及注入培养皿时应摇匀再取，供试液从制备至加入培养基不得超过1h. 3．配制MUG培养基时，务必调pH，否则pH偏高，MUG分解，本身则显荧光。 4.培养时间：供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般在4h、24h?观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，该延长培养至48h再观察结果。 谢谢观看！！