大蒜中超氧化物歧化酶的分离纯化以及其特性探究(翻译)详解.docxVIP

大蒜中超氧化物歧化酶的分离纯化以及其特性探究摘要：本文描述从大蒜中提取超氧化物歧化酶的℃一种简单易行、经济实惠的方法。其分离纯化分为三个部分：PBS氯仿-乙醇提取，丙酮沉淀和DEAE离子交换层析。大蒜SOD的酶活力为4124U/mg，回收率为53.3%，浓缩系数是192。SDS电泳分析显示大蒜SOD具有高度的一致性，当pH为4-11时，SOD的酶活将会在很大程度上被氰化物和过氧化氢抑制。经验证，温度低于50℃或超声波处30min，酶的活力仅有轻微的减少，大蒜SOD的最大吸收峰值为269nm。关键词：超氧化物歧化酶，大蒜，提纯，色谱法1.引言虽然大蒜药用已经有几千年了，但是直到最近才研究其作用方式。大蒜不仅可以抑菌、抗病毒、抑制真菌和原生动物，而且对心血管和免疫系统有很好的功效1。很多年来来，对打算的研究报告一直集中在其作为抑菌要的方面，从而忽视了其他的药理学作用2-5。及其有报道称大蒜SOD有其独特的药理作用。6对于生命有机体，超氧化物歧化酶（SODEC1.15.1.1）是一种十分重要的金属螯合酶，可催化有害的超氧化物阴离子歧化生成过氧化氢和氧分子。基于其抗氧化作用，SOD一直被用于医学治疗、化妆品和其它化学工业7.8.目前大部分的SOD都是从动物血浆或植物细胞中提取，这些组织中含量低，提取工艺复杂，提高SOD的生产成本，这限制了它更广阔的应用。研究表明，打算是含有SOD最为丰富的植物，100g大蒜中的SOD酶活力范围2000-3000U，远超过另一种SOD含量丰富的植物——刺梨，然而，之前很少有研究大蒜的SOD及其作用机制。直到现在，大蒜的研究只是涉及SOD的详细分子结构和部分药理作用。本文介绍了一种有效、经济实惠的提取纯SOD的方法，这不仅为后续成本低廉可生物再生新型的提取方法提供方向，也对大蒜SOD的药理功能的进一步探究奠定了基础。2.材料和方法2.1原材料大蒜（中国广州市购买），标准牛血SOD（天津应用生命科学研究所）2.2大蒜的预处理去皮，将蒜瓣放入搅拌器到捣碎2.3磷酸缓冲液提取100g蒜泥中加入300mL磷酸缓冲液（50mmol/L，pH7.4）室温下浸提40min，再用200mL磷酸缓冲液反萃取大蒜渣两次，过滤，取清液。2.4氯仿-乙醇提取氯仿和乙醇3:5（体积比）混合，500mL酶提取液加入130ml的有机溶剂，搅拌15min，离心（10000g）15min。上清液道路分液漏斗静置15min，弃去水相，将酶相倒入真空蒸发仪50℃浓缩至124ml。离心（10000g）10min，沉淀杂质，取上清液进行酶活和蛋白质含量的测定。2.5丙酮沉淀法缓慢地向上清液中加入冷丙酮（-20℃），轻轻搅拌15min，离心（10000g）15min，取沉淀，溶解在磷酸盐缓冲液中，4℃透析12h。2.6DEAE离子交换层析梯度解析：用2.5mmol/L（pH7.0）至300mmol/L（pH7.8）的磷酸缓冲液以1.1mL/min的洗脱速率进行洗脱。收集各级样品。检测每一部分的蛋白质含量和酶活力，将含酶的部分统一进行透析除盐和冷冻干燥处理。2.7 SDS电泳根据Laemmli9的12.5%聚丙烯酰胺凝胶实验，利用SDS电泳分析酶的浓度，0.1%考马斯亮蓝R-250对蛋白质染色。2.8蛋白质测定采用lowry10等人的方法，牛血SOD为标准物，测定蛋白质含量2.10大蒜SOD的pH 稳定性的测定用下列的缓冲液调节纯化酶的pH值（pH2.0-11.0）HCl/CH3COONa (pH 2.0–4.0)，CH3COONa/CH3COOH (pH4.0–5.5)，NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 5.5–7.5)，Tris–HCl (pH7.5–9.0)和NaHCO3/Na2CO3 (pH 9.0–11.0)，37℃，30min，牛血SOD作比较，测定酶活力的最佳pH为7.8。2.11大蒜SOD的热稳定性酶溶解在不同温度的磷酸缓冲液（0-70℃），保持60min，测定酶活。2.12紫外线对大蒜SOD的影响0℃，4r/s超声波处理(ACX 400 Ultrasonicator, 20 kHz, Sonic and Materials, Newton, MA, USA)，15s，测定酶残余活力。3.实验结果3.1大蒜SOD的提取和纯化3.1.1磷酸缓冲溶液提取磷酸缓冲液提取大蒜SOD三次，实验结果如表1所示，实验表明，两次提取可以达到总酶活力的99%。表1.磷酸缓冲液提取大蒜SOD提取次数总酶活力（U）总酶活性的提取百分比（%7221007.532400.83.1.2氯仿-乙醇提取氯仿-乙醇处理后，SOD活力仅减少4.8%。当总蛋白浓度下降81.6%时，酶比活力提高3417.2%，如表2所示表2.氯仿-乙醇提取大蒜SO