微生物的生长与纯培养.ppt

第五章 微生物生长及纯培养 微生物生长及纯培养 微生物生长的测定 微生物群体的生长规律 微生物的分离和培养 一、微生物生长的测定 微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体的生长很难测定，而且也没有什么实际应用价值。因此，在微生物学的研究和应用中，通常是测定群体的增加量，即群体的生长。 测定不同种类、不同生长状态微生物的生长情况，需要选用不同的指标。通常对单细胞微生物来说，既可测定细胞数目，又可测定细胞的质量；而对多细胞微生物(尤其是丝状真菌)，则常以菌丝生长的长度和质量等作为生长指标。 直接计数法 间接计数法 （一）直接计数法 1、显微计数法 采用血球计数板置于显微镜下进行计数，将一定稀释度的细胞悬液加到计数室中，在显微镜下进行计算细胞个数，每个小室内4—5个细胞为宜 该方法操作简便、快速，适用于单细胞的微生物测定，通过染色，可以鉴别活菌和死菌 2、比浊法 原理：当光线通过微生物菌悬液时，菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。 利用浊度计或比色计测定, 得到OD值，与细胞数量成正比，还可进行平板计数，对比一定浑浊度所含活菌数作曲线。适用于菌体分散良好的非菌丝体的单细胞微生物的测定。 该方法简便、快捷、可以连续测定，适用于发酵生产过程的监测菌体生长情况，被广泛利用。 3、平板菌落计数法 是一种常用的活菌计数法。 将被测菌体稀释到一定浓度，取一定量的稀释液接种到平板上，培养后可形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落则代表一个细胞，计算菌落数。根据稀释倍数与吸样量可推算出细胞数目。 一般用9cm的培养皿，每个稀释度作3个平皿培养，取平均值，通常每个平板长30～300个菌落为宜。 平板计数法可分为两种：涂布法和倾注法。 该方法多用于教学、科研、食品检验，在测定水、土壤、食品、化妆品及其他材料的活菌测定。 4、干重测定法 可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10～20%，将待测培养液离心或过滤后，用清水离心洗涤1～5次，进行干燥，然后称干重。干燥温度可采用100～105℃烘干或置于真空干燥箱中60～80℃，也可在红外线烘干，恒重后称重。 注：培养物中除菌体外无其它固体颗粒。 若是固体培养物，则可先将其溶化再过滤或离心出菌体。 对单、多细胞均适用，是测定菌丝体的常用方法。  主要对丝状真菌生长长度的测定，一般在固体培养基上进行，有两种方法。 将真菌接种在平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积，直到菌落覆盖整个平皿为止，绘制生长曲线。缺点：不能反映菌丝的纵向生长。 6、液体稀释法 是一种常用的活菌计数法。 对被测样品做连续的10倍系列稀释。根据估计数，从最适宜的3个连续的10倍稀释液中各取5ml试样，接种到3组共15支装有培养液的度管中（每管接1ml）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大概率表（MPN），再根据稀释倍数计算出活菌含量。 1、测定细胞组分的含量进行估算 每种微生物细胞中核酸及蛋白质的含量较为恒定，另外ATP的含量也较为稳定，所以一般采取以下方法进行间接测定。 测定DNA的含量 测定蛋白质的含量 测定ATP的含量 2、从培养基中某营养物的消耗量来估算 营养物质不能是合成代谢的产物，如磷酸盐。 3、从菌体代谢产物来估算 4、从发酵液的黏度来估算 5、从发酵的放热量来估算 6、从发酵液的酸碱度来估算 在发酵过程中，微生物的生长及代谢产物的产生，会使体系的PH值发生一定的变化。 二、单细胞微生物的生长曲线 多数细菌的繁殖速度很快。大肠杆菌在适宜的条件下繁殖48h，其子代总重可达2.2×1031g，这是一个巨大的数字。然而，实际情况是不可能的。那么，细菌的群体生长规律到底怎样呢? 将少量单细胞细菌纯培养物接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定细胞含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细胞数量并不增加，随之细胞数目增加很快，继而细胞数又趋稳定，最后逐渐下降。 如果以培养时间为横坐标，以细菌细胞数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为生长曲线。 微 生 物 典 型 生 长 曲 线 生长速率常数R：单位时间内的繁殖的 代数。 代时G:细胞每分裂一次所需的时间。 R=1/G 稳定期到来的原因 1、营养物尤其是生长限制因子的耗尽 2、营养物的比例失调 3、有害代谢产物的积累 4、pH值等理化条件不适宜 x—为稳定时期细胞干重（g/ml培养液）x0—为刚接种时的细胞干重（g/ml培养液） c0—为限制性营养物的最初浓度（g/ml）c—为稳定时期限