第六章凝胶层析法.ppt

* 凝胶层析法 一．凝胶层析(Gel chromatography) 凝胶层析也称： 排阻层析(ellusion chromatography) 凝胶过滤(gel filtration) 分子筛层析(moleculer sieve chromatography) 凝胶层析中常用凝胶的类型（4种主要类型） 葡聚糖凝胶： Sephadex； 琼脂糖凝胶 Sepharose； 聚丙烯酰胺凝胶 Bio-Gel p； 琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶 Superdex 二．凝胶层析法特点： 1．设备简单，操作方便 2．对高分子物质有良好的分离效果，重复性高 3．分离条件缓和，不改变样品的生物学性质 4．应用广泛。分离纯化、脱盐、浓缩 5．分辨率不高，分离操作较慢 一．凝胶层析的机理 1．固定相：由惰性的凝胶颗粒组成。 2．流动相：也叫缓冲溶液，洗脱剂。 二．凝胶层析的物理特性： 1．排阻极限（排阻限）：指不能扩散进入凝胶颗粒网孔内部的最小溶质分子。 2．分级分离范围：某种凝胶允许溶质分子量在多大范围内能得到线性分离。 3．得水值：每克干胶吸收水的克数（mL数）。 4．床体积：凝胶和凝胶颗粒周围水分的总体积（mL/g干胶）。 型号 分离范围 （分子量） 吸水量 （ml/g） 床体积/干凝胶 （ml/mg） G10 ＜700 1.0±0.1 2~3 G15 ＜1 500 1.5±0.2 2.5~3.5 G25 ＜5 000 2.5±0.2 4~6 G50 1500～20 000 8.0±0.3 9~11 G75 3 000～70 000 7.5±0.5 12~15 G100 4 000～15 000 10.0±1.0 15~20 G150 5 000～800 000 15.0±1.5 20~30 G200 5 000～30 0000 20.0±2.0 30~40 5．凝胶颗粒形状和大小。 ①.凝胶颗粒都成球形，内部有高密度网孔构。 ②.颗粒大小有二种表示方法： a.以筛目的大小表示（目）； b.以干颗粒直径表示（μm）。 三．凝胶层析分离的过程 1．Vt (total volume) 总体积：凝胶柱床容积。 由三部分组成：Vt=Vo+Vi+Vg 2．Vo (outer volume) 外水容积（外容积或孔隙容积）:存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积。 3．Vi (inner volume) 内水容积，即凝胶颗粒内部所含水相的容积。 4．Vg 凝胶本身的容积。 三．凝胶层析分离的过程 三．凝胶层析分离的过程 5．Ve (elution volume) 洗脱容积： Ve=Vo+KdVi 。 自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流 出的容积。 6．Kd：样品组分在两相间的分配系数。 7．Kd: 通过实验可求得。 Ve=V0+Kd?Vi Kd=(Ve-Vo)/Vi 8．Kd有下列几种情况： ①.当Kd=0时 Ve=Vo (全排阻)。 ②.当Kd=1时 Ve=Vo+Vi (全渗入) ③.当 0 Kd1时 （部分渗入）。 ④.当Kd1时 即VeVo+Vi 表示凝胶对组分有吸附作用。 凝胶的实验条件： 1．凝胶必须是化学惰性的。 2．凝胶的化学性质必须是稳定的。 3．凝胶上没有或只有极少量的离子交换 基团。 4．凝胶必须具有足够的机械强度。 一．凝胶的选择： 1．凝胶的交联度越高，孔径越小。 2．对大分子物质的分离，多采用琼脂糖。 3．对小分子物质的分离，多采用葡聚糖。 4．凝胶颗粒的粗细影响分离效果。 二．凝胶的用前处理 1．除去影响流速的过细颗粒 “水力浮洗法”：将颗粒粗细不均的凝胶悬浮在大体积的水中，让它自然沉降，过细的颗粒浮在上面，倒去即可。反复几次。 2．溶胀 使用前需直接在欲使用的洗脱液中浸泡溶胀。通常使用“热法”溶胀，即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温到近沸，1~2小时即可。 三．装柱 1．装柱：先在柱中加入约1/3高度的洗脱液，边搅拌边加入凝胶悬浮液。 2．平衡 3．检查柱子是否均匀 四．样品的上柱及洗脱 1．柱床表面要平整。 2．使洗脱液流至距柱床表面1~2mm时关闭出口。 3．以层析允许最小体积的样品，用滴管慢慢加入（一般为0.5mL）。 4．水溶性物质的洗脱用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。 非水溶