第二章蛋白质的性质.pptVIP

变性 蛋白质空间结构被破坏;生物活性丧失; 物理化学性质发生改变(溶解性降低；粘度增加) 一级结构未发生改变；分子量不变 易被蛋白酶降解 影响蛋白质变性的因素 物理因素 高温 紫外 剧烈振荡/搅拌 高压 超声波等 化学因素: 酸碱 有机溶剂 尿素等 蛋白质的沉淀 活性蛋白的沉淀 有机溶剂沉淀 原理: 破坏蛋白质分子外层水膜，加强蛋白质分子之间的相互作用. 常用的有机溶剂: 乙醇 丙酮 注意！ 低温下操作 缩短操作时间 硫酸氨沉淀(盐析) 原理: 与自由水分子结合 破坏蛋白质分子的水分子层 加强蛋白质分子之间的相互作用 常用的中性盐: 硫酸铵 等电沉淀 原理 在pI点，蛋白质分子所带静电荷为0，无静电作用力 实际通常会将等电沉淀与有机溶剂或硫酸铵沉淀结合起来进行 非活性蛋白的沉淀 热凝固： 豆腐 soybean milk boiled magnesium chloride or acid added proteins precipitated 重金属： 适宜的pH条件下，蛋白质可以与重金属结合 生物碱试剂: 苦味酸，三氯乙酸，鞣酸等 当pH低于pI时,蛋白质分子带正电荷，可以与带负电的生物碱试剂发生反应形成沉淀。 第5节 蛋白质的纯化 原理 溶解性 (pI沉淀, 盐析, 有机溶剂, 温度) 蛋白分子大小 (透析, 超滤, 密度梯度,凝胶层析) 电荷 (电泳、离子交换) 特异性的亲和作用(亲和层析) S1 蛋白样品的选择 蛋白含量丰富 来源广 S2 预处理 破碎细胞的途径 均质 超声波 高压 纤维素酶 溶菌酶 膜蛋白 以去垢剂破坏膜的脂双层，使膜蛋白完整地释放出来 离心 S3 粗蛋白的制备 有机溶剂沉淀 硫酸铵沉淀 等电沉淀 S4 蛋白的纯化 离子交换 凝胶层析 亲和层析 离子交换 依据蛋白质分子所带的静电荷来分离 阴离子交换层析：用于分离带正电荷的蛋白质分子 阳离子交换层析：用于分离带正电荷的蛋白分子 通常以NaCl溶液进行蛋白洗脱 凝胶过滤层析 根据蛋白分子的大小进行分离 (分子量) 原理: 大的蛋白分子不能进入填充物的孔径中直接从柱底端流出；小的蛋白分子能够进入填充物的孔径中，因而流出柱底端需要的时间更长。 估算蛋白质的分子量 亲和层析 原理 蛋白质的配基被固定在不溶性载体上装入柱内. 只有目的蛋白可与配基结合，其它杂蛋白流出柱外. 洗脱纯蛋白 纯化过程中蛋白质的稳定性 pH 溶液的pH要严格控制，使蛋白质稳定存在 温度 温度维持在25 ℃以下 (通常大约4℃ )，避免蛋白的热变性 蛋白酶抑制剂 通常在缓冲液中加入蛋白质抑制剂以避免蛋白质的水解 * * 第4节 蛋白质的性质 有机溶剂沉淀 硫酸氨沉淀 等电沉淀 优点： 操作简单 室温下操作 无时间限制 可以通过过滤或透析除去样品中的中性盐 蛋白质纯化的步骤 蛋白样品的选择 预处理 (均质和溶解 ) 粗提(有机溶剂, 硫酸铵, 等电点) 纯化(离子交换, 凝胶过滤, 亲和层析,电泳等) 纯蛋白